蛋白质与蛋白组学

会不会是蛋白降解了？我最近也遇到这种问题，突然就再也做不出来了，不知道是不是和我蛋白多次在室温融化有关，多多交流啊

==============

说的有点道理

你好，我刚开始接触实验室，懂得很少。
我想问的是：做wb实验时，每个实验组需要有多少条带，才有统计意义。
如果仅仅定性又需要多少呢。
谢谢

==================

定性就看你自己了
统计至少n>3

楼主你好,本人最近作western发现电泳时条带不是压成一条线，而是很宽，请您分析一下原因，以前我做好像不是这样的。谢谢

==============

怎么个宽法？
传图片看看

楼主，您好！我准备做ERK、P-ERK1/2 及 IκBα、P-IκBα的实验，请问：
1、这几个的分子量都特别近，42-44-39-40KD等，是不是至少跑2次胶？一块胶先做磷酸化再做非磷酸化？最后再做内参？还是每个都单独跑，还有内参，共跑5次？但是磷酸化或非磷酸化分子量都基本接近，如进行二次洗膜后实验能能确定是后者的抗体吗？
2、这几个蛋白的分离胶浓度是15%还是10%呢？（我在园子里看有的建议8%分离胶）电泳条件？（可以先80V半小时，在120V1小时吗？）转膜条件？(我们实验室看师兄们用的是转膜横流0.24mA 2个小时，时间会不会长了？)
3、内参选用什么合适呢？单独跑一次吗？还是每次都要跑？
4、每次电泳液和转膜液都换新的吗？
5、ERK的42和44 ，是不是不容易跑分开？
6、因为磷酸化蛋白少，上样100微克会不会太多？（我们实验室师兄们甚至上到150微克的蛋白啦）
7、上样根据蛋白浓度调整统一浓度，但上样的总的体积不同，需要用什么把体积也统一吗？还是不需要？
8、我看有的帖子说无干扰也有P-ERK的微量表达?也就是空白对照组也能出现极弱的条带？

============================================================================================================

1、我做磷酸化与非磷酸化一般是做两块胶，有很多人用stripping buffer处理后在一张膜上做，也可以试下，先做磷酸化再做非磷酸化最后再做内参
2、可以用12%的分离胶啊，转膜300mA，1h，湿转
3、内参可以用beta-tubulin
4、电泳与转膜都要用新的，如果你用回收的也行。电泳时外槽可以用回收的，内槽必须用新的！转膜的就不必要用回收的吧
5、ERK 42、44容易分开，这几个蛋白很常见，很好做。上个月我做了技术服务就有ERK的蛋白，CST的抗体，效果非常好。
6、我做WB不管是磷酸化蛋白还是非磷酸化蛋白上样量在20-40ug之间，从来没有超过40ug。用BCA定量
7、把蛋白浓度调整成一致啊！上样量与上样体积都能调整成一致。
8、p-ERK无无干扰也有微量表达是对的，你想啊在正常生理状态下如果没有磷酸化蛋白执行功能机体怎么存活？

另外，现在手头有师姐留下的actin，可以将就用来做内参嘛？

============================

可以做内参
但是需要用stripping buffer洗膜

1、8%的胶分离70-80效果要好于10%
2、重复3、4次，里面的BSA还没坏？
3、actin像括号是因为上样量太大，另外是转膜后抗体孵育不完全造成两边细
4、上样量控制的看预实验条带啊。。。
5、转膜我没用过恒压

===============================================================================================================

谢谢老师的解答，真是恍然大悟，今天换新抗体，加大孵育量试试。另外我转膜用的是bio-rad半干转印仪，电压不超过25V的那款，之前是想用恒流，120mA、200mA都试过，但电压会一直升最后超过25V，就不敢用了。是做三明治出问题了吗？因为恒压转最后电流也会下降。
另外丽春红染条带都很清晰，是不是能确定蛋白没降解？最终没条带就不是蛋白的问题了吧？