【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

6097 286/610 |‹‹‹284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

2851

发表于 2013-3-7 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做了好多次WB，总是发现曝光往往不尽如人意，我用的是FUJIFILM LAS 4000进行曝光，经常出现虽然有目的条带，但是背景色很浓的情况，不知道是什么原因？？
有人说这个可能和显影液有关，我用的是超敏的，有人建议我用下非超敏的，有人又说和显影液没有关系的？
我每次曝光时也没有对机子进行过任何的设置。。。是不是曝光时间过长了，我是10s每次？
我做出来的条带

===================

减小一抗、二抗浓度

okhaha[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77505
精华 0
积分 548
帖子 756
信誉分 100
可用分 4651
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

2852

发表于 2013-3-7 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好，我做western 快一年了，做小分子的western 都挺好p-akt，akt都很好，但eNOS,iNOS,P-eNOS 一直做不出来，转膜后用丽春红然后不出条带，

kulee[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77361
精华 0
积分 615
帖子 849
信誉分 100
可用分 5127
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态离线

2853

发表于 2013-3-7 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、细胞来源相同吗？确定抗体能识别的种属
2、查对一下你用的试剂与你同学用的之间有什么差别

==============================================================================================================

细胞来源相同，都是人的，只是后者施加了干预；和同学的试剂没什么差别。
前天用湿转，内参已经有了结果，只是条带很暗，提高二抗浓度到1:3000，结果好像没什么改善。湿转比半干转能转移更多的蛋白，同学用半干转相同转膜条件、相同内参抗体、相同二抗浓度，他的条带就很亮，这是不是说明我的蛋白有所降解呢？

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

2854

发表于 2013-3-7 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好，我做western 快一年了，做小分子的western 都挺好p-akt，akt都很好，但eNOS,iNOS,P-eNOS 一直做不出来，转膜后用丽春红然后不出条带，

==========================

NOS用的是哪个公司的抗体？
用什么提取蛋白？

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

2855

发表于 2013-3-7 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞来源相同，都是人的，只是后者施加了干预；和同学的试剂没什么差别。
前天用湿转，内参已经有了结果，只是条带很暗，提高二抗浓度到1:3000，结果好像没什么改善。湿转比半干转能转移更多的蛋白，同学用半干转相同转膜条件、相同内参抗体、相同二抗浓度，他的条带就很亮，这是不是说明我的蛋白有所降解呢？

==================

换用你同学的样品试试

wood533[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

2856

发表于 2013-3-7 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

丙烯酰胺过期了能不能用？假如过期了，对实验有什么影响？谢谢！

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

2857

发表于 2013-3-7 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

丙烯酰胺过期了能不能用？假如过期了，对实验有什么影响？谢谢！

============================

不建议使用
ACR是起分子筛作用的
这个过期了分子筛作用就减弱了

orangecake[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77305
精华 0
积分 512
帖子 724
信誉分 100
可用分 4431
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

2858

发表于 2013-3-7 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

显影的时候我们都是先把膜用滤纸吸干，再涂发光剂，保鲜膜覆盖，压片。请问，有更好的方法吗？

hot_hot_hot[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76450
精华 0
积分 389
帖子 498
信誉分 100
可用分 3247
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

2859

发表于 2013-3-7 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我有两个问题请教一下
1.我的WB重复性很不好，同样的条件，这一次很容易就能做出来，而下一次却怎么也做不出来，这期间试剂、抗体浓度、时间都没有改变，转膜完了立春红染色条带也很好，请问是怎么回事儿呢？

2.我的目的蛋白分子量在200KD左右，我用8%的胶跑电泳，条带出来经常是一个弥散型的，上下很宽，边缘也不清晰，但有几次却显的很好，条带细细的，这是为什么呢？

这个就是显的比较好的条带：

附件

2013-3-7 15:45

2v8oh9v.jpg (834 Bytes)

hot_hot_hot[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76450
精华 0
积分 389
帖子 498
信誉分 100
可用分 3247
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

2860

发表于 2013-3-7 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个是多数情况下的条带：

附件

2013-3-7 15:45

9zwrc9.jpg (2.82 KB)

6097 286/610 |‹‹‹284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 ›››|