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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-7 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好
我每次提的细胞蛋白浓度都很低 0.3-0.5毫克每毫升
我用的是六孔板 吸去上清 用PBS洗三遍 没孔加200微升RIPA和2微升PMSF在冰上三十分钟 然后用枪头（因为没有细胞刮刀）刮或不刮我都试过。怎么每次的蛋白浓度都很低呀 我的操作有没有问题呀 请老师指教 谢谢！
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8s5g[使用道具]
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发表于 2013-3-7 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有个问题麻烦您给我帮个忙！
原来的wb作的好好的，但是最近几天发现条越来越浅，最后几天根本做不出来了，一抗akt 是cst的（1：1000），beta-actin(1:2000)是康为的,二抗都是康为的。是这样：头几次实验，我加完ecl 5分钟后，暗室发光没有带，然后我把膜放在tbst 里跑了一会，接着又加了ecl 5分钟后，再去暗室发光，就有带了，这是怎么回事。我怀疑是2抗的浓度太高，就少加了2抗（1：8000），结果根本没带。一抗孵育4h ,rt,2抗1小时，封闭半小时！
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发表于 2013-3-7 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上：
一抗不要再室温孵育这么长时间！
二抗孵育30-40min，康为的二抗请用1:10000稀释
康为的ECL？
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发表于 2013-3-7 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好
我每次提的细胞蛋白浓度都很低 0.3-0.5毫克每毫升
我用的是六孔板 吸去上清 用PBS洗三遍 没孔加200微升RIPA和2微升PMSF在冰上三十分钟 然后用枪头（因为没有细胞刮刀）刮或不刮我都试过。怎么每次的蛋白浓度都很低呀 我的操作有没有问题呀 请老师指教 谢谢！

=============================================================================================================

1、提取蛋白前先加PMSF到RIPA中混匀再加入6孔板提取蛋白。PMSF加入RIPA后到加入到6孔板不要超过30min，如果超过30min没开始提取蛋白，请重新加PMSF
2、RIPA加100ul就够了
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发表于 2013-3-7 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、提取蛋白前先加PMSF到RIPA中混匀再加入6孔板提取蛋白。PMSF加入RIPA后到加入到6孔板不要超过30min，如果超过30min没开始提取蛋白，请重新加PMSF
2、RIPA加100ul就够了

==========================================

1、我是提前把PMSF加到RIPA中混匀再加入6孔板的。
2、我下次加100ul试试。O(∩_∩)O~
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发表于 2013-3-7 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
、我是提前把PMSF加到RIPA中混匀再加入6孔板的。
2、我下次加100ul试试。O(∩_∩)O~

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细胞最好长满90%
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发表于 2013-3-7 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两个目的蛋白，95kD和50kD大小，以前用300mA，但是温度降不下来，而且，发现曝出来的条带两头大，中间很淡，所以想减少电流。分别用200mA 2小时 和200mA 1小时可否啊？谢谢！
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发表于 2013-3-7 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 avi317 于 2013-3-7 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两个目的蛋白，95kD和50kD大小，以前用300mA，但是温度降不下来，而且，发现曝出来的条带两头大，中间很淡，所以想减少电流。分别用200mA 2小时 和200mA 1小时可否啊？谢谢！ ...

1、可以同时转膜，300mA 2h
2、中间很淡这种情况考虑电泳上样量是不是有点大，抗体孵育是否完全等
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发表于 2013-3-7 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要号一下嘛？
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发表于 2013-3-7 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要号一下嘛？

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可以用冰袋给它降温啊
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