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标题:【讨论帖】western blot问题解答

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-3-7 18:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、可以同时转膜，300mA 2h
2、中间很淡这种情况考虑电泳上样量是不是有点大，抗体孵育是否完全等

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要好一些嘛？
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-3-7 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

300mA 2h
北京六一电泳仪，是否太大了？
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发表于 2013-3-7 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
白血病
大家好，我用RIPA提取白血病细胞总蛋白，蛋白浓度2-3ug/ul,做hTERT(端粒酶逆转录酶 127KD，核蛋白)的WB。分离胶8%，上样量30-60ug，湿转250-300mA,120min.PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗 ab32020 1：1000-750 4度过夜，二抗1：3000-5000 2小时，ECL发光，加了发光液始终不见荧光，曝光时间5-30分钟，做了七八次了，始终没条带。极度郁闷！

我的疑问：
是否换用核蛋白提取试剂提取蛋白会好些？有何推荐吗？
ABCAM 该一抗出了问题？
或者其他步骤可以再改进的？
请指点迷津，不胜感激！
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发表于 2013-3-7 18:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、可以同时转膜，300mA 2h
2、中间很淡这种情况考虑电泳上样量是不是有点大，抗体孵育是否完全等

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要好一些嘛？

==========

呵呵
可以试试
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发表于 2013-3-7 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我用RIPA提取白血病细胞总蛋白，蛋白浓度2-3ug/ul,做hTERT(端粒酶逆转录酶 127KD，核蛋白)的WB。分离胶8%，上样量30-60ug，湿转250-300mA,120min.PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗 ab32020 1：1000-750 4度过夜，二抗1：3000-5000 2小时，ECL发光，加了发光液始终不见荧光，曝光时间5-30分钟，做了七八次了，始终没条带。极度郁闷！

我的疑问：
是否换用核蛋白提取试剂提取蛋白会好些？有何推荐吗？
ABCAM 该一抗出了问题？
或者其他步骤可以再改进的？
请指点迷津，不胜感激！

===============

ECL是哪的？
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发表于 2013-3-7 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
00mA 2h
北京六一电泳仪，是否太大了？

==========================

DYY-6C，7C都可以达到400mA
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发表于 2013-3-7 18:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
300mA 2小时会不会转过了啊？
95kD和50kD大小，分别用200mA 2.5小时 和200mA 1.5小时可否啊？谢谢！
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发表于 2013-3-7 18:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 avi317 于 2013-3-7 18:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
300mA 2小时会不会转过了啊？
95kD和50kD大小，分别用200mA 2.5小时 和200mA 1.5小时可否啊？谢谢！

300mA 2h当然不会转过
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-3-7 18:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
50kD大小的蛋白不能用这样的条件吧？
我转1.5小时，膜上的marker就不清楚了啊？
这是怎么回事？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-3-7 18:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：杂带很多怎么办呢？封闭2小时，5%牛奶。
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