蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  293/610 |‹‹‹291292293294295296297298299300›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
2921

发表于 2013-3-7 19:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，做WB一段时间了，今天做出来的条带竟然是连成一条直线的，理应空白的地方反而浓聚得很厉害，但是内参GAPDH却是正常的，条带间也是分隔开的，而且目标蛋白的形态也发生了变化。有人说是因为漏胶的原因，但是如果是这个原因为什么内参却没有出现这个问题。
我的上样量为40ug，应该也不算太多吧，以前同样的标准进行都没有什么太大的问题。。。
我现在是相当地困惑啊！！谢谢指导了哦

上面是内参，下面是目标蛋白
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2922

发表于 2013-3-7 19:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wood533 于 2013-3-7 19:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好，做WB一段时间了，今天做出来的条带竟然是连成一条直线的，理应空白的地方反而浓聚得很厉害，但是内参GAPDH却是正常的，条带间也是分隔开的，而且目标蛋白的形态也发生了变化。有人说是因为漏胶的原因，但是如果是这个原因为 ...

1、漏胶的概念是啥？
2、我怀疑你的样品有沉淀
3、是组织样品还是细胞样品？蛋白浓度多少？
顶部
bamboo16[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79663
精华 2
积分 572
帖子 696
信誉分 104
可用分 4391
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态 离线
2923

发表于 2013-3-7 19:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、漏胶的概念是啥？
2、我怀疑你的样品有沉淀
3、是组织样品还是细胞样品？蛋白浓度多少？

========================================================================================

有人说是不是制胶过程胶没有完全凝固，然后在跑电泳的时候就出现异常，但我个人觉得这种可能性不高的说。。。
是组织样品，上样的蛋白浓度是40ug，上样量为12ul
样品有沉淀会出现这种情况？为什么在理应空白的地方出现异常的浓聚啊？
那我需要怎么处理？在使用前再次进行离心？（我组织提取后的离心条件 4度下13000转/分，10min）
谢谢
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2924

发表于 2013-3-7 19:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

组织样品用什么裂解液？
我感觉是沉淀的可能性较大
吸取上清的时候不能带上沉淀或者悬浮在最上面一层的东西
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
2925

发表于 2013-3-7 19:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的RIPA/PMSF以100:1添加
吸取上清时我也比较注意了，可能还是有点沉淀带上了，但我用的蛋白标本有时会重复使用，这次用的标本我以前也是用来跑过WB的，也并没有出现这种情况。。。
那我以后用之前再离心一下取上清，这个操作应该没有什么问题吧？
我提取蛋白时用的13000转/分，10min是不是可以在适当增加点时间？
不甚感激啊
顶部
tangxin_80[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79896
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4621
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
2926

发表于 2013-3-7 19:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我最近做磷酸化蛋白，结果背景很黑，如何处理？谢谢！
顶部
dog002[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76386
精华 0
积分 916
帖子 1452
信誉分 100
可用分 8133
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
2927

发表于 2013-3-7 19:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主：想请教一个问题，关于一抗和二抗浓度调整的问题，我是这样理解的：如果压片后除了目的条带以外，还有杂带，此时需要降低一抗浓度；如果背景比较重的话，比如说整个膜发光，此时需要降低二抗浓度。不知我这样理解对不对
顶部
dog002[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76386
精华 0
积分 916
帖子 1452
信誉分 100
可用分 8133
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
2928

发表于 2013-3-7 19:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的RIPA/PMSF以100:1添加
吸取上清时我也比较注意了，可能还是有点沉淀带上了，但我用的蛋白标本有时会重复使用，这次用的标本我以前也是用来跑过WB的，也并没有出现这种情况。。。
那我以后用之前再离心一下取上清，这个操作应该没有什么问题吧？
我提取蛋白时用的13000转/分，10min是不是可以在适当增加点时间？
不甚感激啊

================================================

1、离心20min
2、第一次取出上清后，进行第二次离心，10min，再取上清
3、蛋白标本是指什么？提取后的蛋白还是组织、细胞？
顶部
dog002[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76386
精华 0
积分 916
帖子 1452
信誉分 100
可用分 8133
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
2929

发表于 2013-3-7 19:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我最近做磷酸化蛋白，结果背景很黑，如何处理？谢谢！

====================

BSA封闭及稀释抗体？
顶部
dog002[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76386
精华 0
积分 916
帖子 1452
信誉分 100
可用分 8133
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
2930

发表于 2013-3-7 19:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主：想请教一个问题，关于一抗和二抗浓度调整的问题，我是这样理解的：如果压片后除了目的条带以外，还有杂带，此时需要降低一抗浓度；如果背景比较重的话，比如说整个膜发光，此时需要降低二抗浓度。不知我这样理解对不对

==============================

可以这么理解
有时候一抗也会带来背景
比如一抗是抗血清还没有做过纯化的
顶部
 6097  293/610 |‹‹‹291292293294295296297298299300›››|