蛋白质与蛋白组学

最近在做海马的BDNF和NGF，用的是millipore的抗体， 分子量分别是18和32，我用的15的胶，做了两次，NGF出来了，但是很难看，BDNF一直就没有看到条带，Maker是很清楚的，具体条件是：电泳恒压70V，PVDF膜电转1.5 h，5%BSA 4度封闭过夜，一抗（1:500）37度2h，TBS-T洗膜10 min，三次，二抗（羊抗兔生物素标记，1:1000）37度，30min，洗膜，三抗（卵白素标记，1:1000），洗膜，曝片。请高手指点

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没做过三抗的WB
三抗用卵白素标记最后用什么检测？

今特前来请教：
我最近做western blot，做了几次结果都没有出来
目的蛋白分子量为140KD，
分别做了8%和10%浓度的凝胶电泳，电泳液配方参照分子生物学试验指南，跑胶时间80V半小时+100V 2小时。转膜湿转，200mA恒流三小时。TBST液10分钟洗1次，5%牛奶液封闭1小时，TBST液5分钟洗3次，分别做了2次，2.5%和5%的牛奶稀释一抗1：1000，冰箱孵育过夜。
第2天TBST液5分钟洗3次，分别做了2次，2.5%和5%的牛奶稀释二抗1：5000，后续曝光、显影、定影。

这几次beta-actin有表达，但是目的蛋白没有表达，阳性对照组也没有目的蛋白的表达。一般X片都很干净，没有什么痕迹。补充，转膜的时候有时可以看到maker的颜色，有时候看不到。

请版主帮我分析看看，哪些条件做些调整，非常感谢！

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什么蛋白？
一抗哪个公司的？货号？
ECL是那得？