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标题:【讨论帖】western blot问题解答

yychen[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近做wb，有十几天了，不管怎么做，胶片都是白纸一张，我把整个体系都检查了一遍，所有的试剂全都是新的，膜用丽春红染后，能看到蛋白条带，很明显，清水洗去丽春红，封闭1h，4度一抗过夜，TBST洗膜三次，每次8min，二抗反应4h-6h，TBST洗膜三次，每次8min，
ECL反应5min，看不到荧光，胶片最后就是白纸一张，连actin也是这样。请问楼主，这是为什么啊？我出错在哪里啊？
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发表于 2013-3-9 09:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yychen 于 2013-3-9 09:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最近做wb，有十几天了，不管怎么做，胶片都是白纸一张，我把整个体系都检查了一遍，所有的试剂全都是新的，膜用丽春红染后，能看到蛋白条带，很明显，清水洗去丽春红，封闭1h，4度一抗过夜，TBST洗膜三次，每次8min，二抗反应4h-6h，TBST洗膜三 ...

1、封闭30min足够
2、洗膜3min乘以5-6次
3、把TBST等涉及到pH的缓冲液好好检查一下
4、以前有结果，现在没结果？
5、二抗反应不要超过1h
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发表于 2013-3-9 09:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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如果你用的是六一的板子的话，可能是由于你制胶的时候板子压的太紧了，以至于你拆胶条的时候板稍微被撑开了一点，，下回你注意下这个问题看是不是。我以前也有多相似的经历。
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发表于 2013-3-9 09:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

碰到一个难题，电泳过程中蛋白跑的很慢，marke也只分开到55kd，并且在溴酚蓝处感觉胶有点厚（就是比其他地方的胶看起来厚些），在加样槽底部会看到有白色颗粒，以为是压分离胶水未吸干和胶未凌好，后来都吸干水，配好胶在室温放了50min才放入4度保存，第二天用。可结果还是一样。以前跑的很好，现在就只重配了tris。
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发表于 2013-3-9 09:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 u234 于 2013-3-9 09:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

碰到一个难题，电泳过程中蛋白跑的很慢，marke也只分开到55kd，并且在溴酚蓝处感觉胶有点厚（就是比其他地方的胶看起来厚些），在加样槽底部会看到有白色颗粒，以为是压分离胶水未吸干和胶未凌好，后来都吸干水，配好胶在室温放了50mi ...

1、重新检查tris的pH值
2、样品是不是有沉淀？变性后离过心吗？
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品变性后没有离心，明天试试把样品离心后再跑。就是提好的样品放在-20度保存怎么又沉淀？是什么原因？电泳时溴酚蓝处胶怎么感觉变厚了，什么原因？以前没看见过、谢了
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发表于 2013-3-9 09:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
冻融一两次没问题
蛋白在进行WB进行过电泳后的染胶吗？

===================================

昨天又做了，条带出来了，就是有点淡。
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发表于 2013-3-9 09:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做western blot的新手，有几个问题想请教，望不吝赐教，先谢谢了！
1、我做的是动物组织的蛋白，分子量160kd左右，上样量为200ug，先用的10齿梳子，100v恒压电泳，2小时，基本就跑到底了，后来换了15齿的梳子，2小时只跑了一大半，请问，我是应该仍然只跑2个小时，还是要一直让它跑到底呢？
2、我用的是10%的胶跑的，效果还可以，内参分子量是40kd左右，用奥德赛直接扫的膜，很清晰，因为我还要做其他的蛋白，有的只有35kd，有的有70kd,请问我仍然用10%的胶可以么（因为想到40kd和35kd差不了多少，而且用丽春红染的，70多的位置也有很清晰的条带）？ 如果可以的话，请问电泳和转膜的时间应该怎样调整呢？（160的那个蛋白275mA恒流1小时，湿转，效果还行）
3、请问电泳缓冲液和转膜缓冲液有严格的pH值的要求么？
4、请问溴酚蓝的饱和溶液一般是百分之几啊？
先谢过了！
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发表于 2013-3-9 09:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，您好！
我是新手，有很多问题请教：
1、做的是凋亡的蛋白，电泳条件是：80v十几分钟，等到分离胶的时候换成120v的电压，等溴酚蓝跑出的时候停止电泳。转膜条件是：80v恒压50min左右，Birored的仪器，PVDF膜。
2、一抗是1：1000孵育的，2h ，二抗也是1：1000的，1h ，封闭是5%的脱脂奶粉4度过夜封闭的。
3、我做WB的时候杂带很多，条带还挺粗的。就是没有目的条带，请问是什么原因？
这些条件都是实验室的师姐师兄给的，他们做的好像还可以，请问一下有什么问题？急救……
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 小中大
样品变性后没有离心，明天试试把样品离心后再跑。就是提好的样品放在-20度保存怎么又沉淀？是什么原因？电泳时溴酚蓝处胶怎么感觉变厚了，什么原因？以前没看见过、谢了

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变性的时候蛋白浓度有多少？
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