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标题:【讨论帖】western blot问题解答

gemei0115[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，我是新手，想咨询您几个问题，我做的蛋白28KD，应该有多大浓度的分离胶呢？12%的还是15%的较为合适呢？还有就是在转膜条件是什么呢？我现在是200mA,1小时，marker都能转过去，但不知道蛋白是不是全转过去了
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发表于 2013-3-9 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
hxg2119 wrote:
老师您好，我是新手，想咨询您几个问题，我做的蛋白28KD，应该有多大浓度的分离胶呢？12%的还是15%的较为合适呢？还有就是在转膜条件是什么呢？我现在是200mA,1小时，marker都能转过去，但不知道蛋白是不是全转过去了

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这个我倒是知道，12%或者15%都可以，12%我认为好一点，另外转膜45分钟左右即可，小分子量就这个要很注意
这里有个攻略，可以看看，比较全
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好，请问提取膜蛋白做WB用什么试剂比较好，万分感谢！
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教老师，我们用的封闭牛奶过期了，09年2月产，12月保质期，今年9月刚开始用，怎么也做不出来，牛奶是不是主要原因？
电泳后染胶可以看到条带，转膜后丽春红染不出色，但是mark都转过去了，再染胶看不到条带了，不知道膜上到底有没有蛋白，会不会转过了
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，最近做WB条带都很淡，不知道和什么原因有关呢？下面这张图，左侧上面是不同浓度，下面是不同时间的，一条颜色就很淡。


查看积分策略说明
附件
2013-3-9 09:29
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发表于 2013-3-9 09:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问的是，取材跟取肌组织，神经组织有区别吗？取材定位及所取组织大小有什么特别的要求吧？谢谢···

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定位看你的参考文献吧
取材于保存都是差不多
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发表于 2013-3-9 09:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是的，原来很强的带，stripping之后带也很弱了

=====================

stripping buffer有问题？
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发表于 2013-3-9 09:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好，请问提取膜蛋白做WB用什么试剂比较好，能否邮箱联系。我的邮箱是万分感谢！

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做膜蛋白的WB可以用提取总蛋白的方法
我的邮箱在我的个人资料中有
如果想提高浓度的膜蛋白，可以试试用胞浆、胞核抽提试剂盒
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发表于 2013-3-9 09:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教老师，我们用的封闭牛奶过期了，09年2月产，12月保质期，今年9月刚开始用，怎么也做不出来，牛奶是不是主要原因？
电泳后染胶可以看到条带，转膜后丽春红染不出色，但是mark都转过去了，再染胶看不到条带了，不知道膜上到底有没有蛋白，会不会转过了

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1、为什么要用过期奶粉？想不通
2、膜也可能过期了或者处理方法不对
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xyw5[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请问下各位前辈一个问题，我的目的蛋白是重组在了有红色荧光蛋白的载体上的，那么我在说WESTERN BLOT的时候我的目的蛋白的大小还是它原先的大小，还是我应该把红色荧光蛋白的大小也加上，才是最终的大小啊？谢谢
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