【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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3061

发表于 2013-3-9 09:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2013-3-9 09:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想请问下各位前辈一个问题，我的目的蛋白是重组在了有红色荧光蛋白的载体上的，那么我在说WESTERN BLOT的时候我的目的蛋白的大小还是它原先的大小，还是我应该把红色荧光蛋白的大小也加上，才是最终的大小啊？谢谢 ...

要加上荧光蛋白

summerxx[使用道具]
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3062

发表于 2013-3-9 09:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教一下，检测细胞培养液中蛋白，最后显出的带型很宽

培养液是10%FBS，是不是浓度太高有影响？或者是浓缩胶不够？我用的是12%SDS-PAGE，转膜250mA 2hours，上样量30ul，蛋白总浓度大概40-50ug

谢谢指点

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3063

发表于 2013-3-9 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呃怎么图片没有了，重新发个，今天的结果依然很郁闷，同样的蛋白，上面的那张膜是不同浓度处理的下面的是不同时间的，上样量和操作都一样，就是不知道问题在哪？为什么上面的那张膜几乎什么都没有？用的是ECL发光试剂盒显影。

附件

2013-3-9 09:33

91565182.jpg (15.17 KB)

qhyu[使用道具]
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3064

发表于 2013-3-9 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有啊，每次我都用脱脂奶室温封闭两小时，洗膜也都是用TBST，为什么杂带还是这么多，背景黑乎乎的，一抗和二抗都是1:1000，做ACTIN背景挺干净的，二抗是抗兔的。

NBA[使用道具]
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3065

发表于 2013-3-9 09:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教一下，检测细胞培养液中蛋白，最后显出的带型很宽

培养液是10%FBS，是不是浓度太高有影响？或者是浓缩胶不够？我用的是12%SDS-PAGE，转膜250mA 2hours，上样量30ul，蛋白总浓度大概40-50ug

谢谢指点

==========================

太宽的话一般与上样量大有关

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3066

发表于 2013-3-9 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有啊，每次我都用脱脂奶室温封闭两小时，洗膜也都是用TBST，为什么杂带还是这么多，背景黑乎乎的，一抗和二抗都是1:1000，做ACTIN背景挺干净的，二抗是抗兔的。

=================================

杂带与你封闭关系不是很大
室温封闭30min足够
目的蛋白的一抗做几个不同的稀释度

子衿青青[使用道具]
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3067

发表于 2013-3-9 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SDS-PAGE电泳后面染色再脱色，同样可以检测目的蛋白，为什么一般都做western-blot，而不做SDS-page呢？
望各位专家指点。

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3068

发表于 2013-3-9 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SDS-PAGE电泳后面染色再脱色，同样可以检测目的蛋白，为什么一般都做western-blot，而不做SDS-page呢？
望各位专家指点。

===================================

SDS-PAGE染色后你能确定目的蛋白吗？

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3069

发表于 2013-3-9 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教NBA老师：我刚做westernblotting ，由于有师兄的带领，程序还比较熟悉。只是很郁闷的是，我做了三次，目的蛋白都是黑带，而内参都是白带。
我的目的蛋白比较大，有180kd，内参是B-actin为43kd，电转3h，3%BSA封闭2小时，一抗1:1000过夜，二抗1:5000 2小时，洗膜后ECL显影，目的蛋白整条带发荧光，内参什么都看不到，曝光后就是目的蛋白黑带，粗黑，很吓人，而内参白带。急死我也！
很是郁闷，想请问老师.我的目的蛋白出现黑带，内参白带的最可能原因是？？？？？
此外，出现黑带和白带有哪些原因造成。非常感谢！

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发表于 2013-3-9 09:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 131415 于 2013-3-9 09:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想请教NBA老师：我刚做westernblotting ，由于有师兄的带领，程序还比较熟悉。只是很郁闷的是，我做了三次，目的蛋白都是黑带，而内参都是白带。
我的目的蛋白比较大，有180kd，内参是B-actin为43kd，电转3h，3%BSA封闭2小时，一抗1:1000 ...

1、蛋白上样量太大
2、二抗浓度太高

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