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标题:【讨论帖】western blot问题解答

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教版主，1为什么显示出泳道而别人则没有泳道
2电泳起始端应该没有蛋白显示，为什么会出现，杂带为什么会出现
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好。楼主，本人刚做WB不久，碰到很多问题，希望楼主多多指教
1.我做的是32Kd的蛋白，转膜是250ma转40min，丽春红染色上面没有条带，请问楼主到底是什么原因那？
2.每次电泳时（恒压条件下）电流都很小，80v的条件下才20mA，请问楼主时什么原因那？
3.每次提蛋白（样品为组织）都是在冰上操作，没有在液氮条件下，请问转不上膜是不是与蛋白没提取出来有关？
谢谢楼主，焦急的在线等！！！
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发表于 2013-3-9 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 taoshengyijiu 于 2013-3-9 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好。楼主，本人刚做WB不久，碰到很多问题，希望楼主多多指教
1.我做的是32Kd的蛋白，转膜是250ma转40min，丽春红染色上面没有条带，请问楼主到底是什么原因那？
2.每次电泳时（恒压条件下）电流都很小，80v的条件下才20mA，请问楼主时什 ...

在进行WB钱请先对蛋白进行SDS-PAGE后的染色
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发表于 2013-3-9 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，跑胶时nonreducing condition和reducing condition有什么区别？谢谢
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发表于 2013-3-9 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，请教！

我本打算做SDS-PAGE，检测的指标是纤维蛋白原，分子量是340kd，可是现在的问题是，我买的Marker是GE公司的，（冻干粉、从66－669kd，五个条带）看说明书后才发现，这个Marker只适用于native electrophoresis，您在9月初的时候也回贴建议我用4-12%梯度胶，GE的说明书跑出的条带也是用的梯度胶。

请问这个梯度胶怎么配，用什么特殊的溶剂么，一点不懂，还有说明书写的是用上样缓冲液稀释Marker，上样缓冲液怎么配，以前的5×SDS不能用了吧，很是郁闷，这些试剂让我准备的乱套了！主要是我做的这个实验是想要判断分子量的变化，没有Marker还不行。
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发表于 2013-3-9 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，跑胶时nonreducing condition和reducing condition有什么区别？谢谢

==========================================================

1、胶没有什么区别
2、non reducing：样品缓冲液中不能含有还原剂，如DTT，beta-巯基乙醇
反之应该含有
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发表于 2013-3-9 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，请教！

我本打算做SDS-PAGE，检测的指标是纤维蛋白原，分子量是340kd，可是现在的问题是，我买的Marker是GE公司的，（冻干粉、从66－669kd，五个条带）看说明书后才发现，这个Marker只适用于native electrophoresis，您在9月初的时候也回贴建议我用4-12%梯度胶，GE的说明书跑出的条带也是用的梯度胶。

请问这个梯度胶怎么配，用什么特殊的溶剂么，一点不懂，还有说明书写的是用上样缓冲液稀释Marker，上样缓冲液怎么配，以前的5×SDS不能用了吧，很是郁闷，这些试剂让我准备的乱套了！主要是我做的这个实验是想要判断分子量的变化，没有Marker还不行。

版主如果有native electrophoresis方面的资料，能帮我发一下么huihui4595@sina.com非常感谢！

================================

native是不能含有DTT等还原剂及 SDS的
梯度胶可以参看《蛋白质技术手册》
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢楼主上次回答我的问题，按照你的指示，我行考马斯亮蓝染色发现天带还是很清晰，我在想是不是转膜时出了问题，我做的是32Kd的蛋白质，转膜时用的是恒流250mA，转40min，你觉得这个条件有问题没有，如果楼主有更好的方法，希望指示！！！
焦急的在线等~~~
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 小中大


QUOTE:
原帖由 xingyi08 于 2013-3-9 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢楼主上次回答我的问题，按照你的指示，我行考马斯亮蓝染色发现天带还是很清晰，我在想是不是转膜时出了问题，我做的是32Kd的蛋白质，转膜时用的是恒流250mA，转40min，你觉得这个条件有问题没有，如果楼主有更好的方法，希望 ...

你的这个转膜条件没问题
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-3-9 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问如果目的蛋白的分子量非常小，大概4 Kd，配胶和转膜有什么要求？谢谢
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