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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-9 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞裂解液 不需要用DTT
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-3-9 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是做Western的新手，想问一下，我转膜完后，用丽春红染色，一个条带也看不出来，请问这是转膜没转上吗？谢谢！
注：80V稳压电泳，约100min，350mA湿转2.5h。
因为刚开始做，不太清楚，辛苦版主啦
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发表于 2013-3-9 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tianmei001 于 2013-3-9 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是做Western的新手，想问一下，我转膜完后，用丽春红染色，一个条带也看不出来，请问这是转膜没转上吗？谢谢！
注：80V稳压电泳，约100min，350mA湿转2.5h。
因为刚开始做，不太清楚，辛苦版主啦 ...

1、蛋白电泳染胶了吗？首先确保有蛋白
2、转膜后染胶了吗？
3、用预染marker没有？如果用了在膜上有没有呢？
别是电极放反了
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发表于 2013-3-9 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好！接着请教你问题：如果丽春红染色后，直接封闭，附抗体可以不，丽春红对其影响大不，谢谢指教！！！
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 小中大
楼主，你好。我想问下，血清做western blot需要怎么处理啊？稀释一般用什么啊？谢谢
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 小中大
楼主你好！接着请教你问题：如果丽春红染色后，直接封闭，附抗体可以不，丽春红对其影响大不，谢谢指教！！！

===============

丽春红没有影响
可以直接封闭
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 小中大
楼主，你好。我想问下，血清做western blot需要怎么处理啊？稀释一般用什么啊？谢谢

=====================

蛋白浓度调整至2-4mg/ml
不要太高
可以用PBS稀释
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发表于 2013-3-9 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

O--------Occludin
V--------VEGF
B------beta-action
一抗是santa的，The VEGF was suggested 1:350,occluding was 1:100
大家看看主要原因是啥？40ug/孔 小鼠视网膜提取的蛋白，5%的脱脂奶粉室温封闭2小时，二抗也是室温2小时 洗膜10min × 4

VEGF、Occludin一点条带都没 内参还可以


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发表于 2013-3-9 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近想做western 对western还不是很了解 弱弱的问一下 如果用细胞做western是不是必须是活细胞啊？培养好后在冰箱冻存的细胞能不能做啊？谢谢
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 小中大
最近想做western 对western还不是很了解 弱弱的问一下 如果用细胞做western是不是必须是活细胞啊？培养好后在冰箱冻存的细胞能不能做啊？谢谢

==================

冻存的细胞可以做
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