小中大楼主好，继续向您请教：
1，大鼠脑组织，处死之后迅速取脑，大脑分两半，称重大约0.2g，分别加入2000ul碧云天RIPA裂解液（强），（之前裂解液按要求加入PMSF），剪碎，超声裂解，裂解几秒，拿出，再超声，（期间放在冰盒上，操作也在冰上）。孵育半小时，4度离心机10000g10分钟，取上清，测蛋白浓度10mg/ml,蛋白一直放入-70冰箱。
2，目的蛋白为Rb蛋白，分子量105kd左右，定位在核内。
3，一抗是abcam的，二抗是碧云天的，发光是碧云天ECL。
4，上样量曾经上过16ug，40ug，80ug，100ug，一抗最高浓度了1：200，4度过夜。之前封闭5%脱脂奶粉1.5小时。
5，5%浓缩胶，10%分离胶，电泳80v，100v，彩色MARKER跑的很齐，曾经考染胶，有大量蛋白条带，但不确定是什么蛋白。湿转膜250mA，2小时，0.45NC膜，膜上MARKER转的很清晰，没用丽春红染过。
6，内参actin，做出来了，P21也做出来了，p21也是核内的蛋白。Rb，p21，actin在同一张胶切的。
请楼主分析Rb白板原因
补充：我看abcam一抗里有叠氮钠，但是在后面会洗掉的吧，不会影响HRP的二抗了吧，洗膜TBST 4X10分钟。
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按你的描述，操作没问题
现在怀疑ECL敏感性低
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为什么P21和内参做出来了，ECL敏感性不够吗？有什么依据吗？和Rb蛋白分子量有关？
不过已经出来的这两个条带确实不怎么黑，也是时浓时淡。
