蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  325/610 |‹‹‹323324325326327328329330331332›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3241

发表于 2013-3-9 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的目的蛋白分子量是33kD，转膜条件应该为150-180mA,30-40分钟，（按0.8-3.0mA/cm2），封闭时间最好长点，我一般室温3-4小时，一抗4度过夜，二抗2-3小时（室温）
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3242

发表于 2013-3-9 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是配胶玻璃架插入电泳槽是，两边胶皮垫没卡紧，漏电泳液，或配胶玻璃间有缝隙，应该涂少许凡士林，
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3243

发表于 2013-3-9 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的目的蛋白分子量是33kD，转膜条件应该为150-180mA,30-40分钟，（按0.8-3.0mA/cm2），封闭时间最好长点，我一般室温3-4小时，一抗4度过夜，二抗2-3小时（室温）

================================================================

你好，谢谢你的回复，不过为什么我同学用250mA的可以跑出我的目的条带呀？
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3244

发表于 2013-3-9 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主您好！

最近做WB用TMB显色
（这是我用的配方：
buffer:0.1M 柠檬酸+0.2M Na2HPO4 pH5.0-5.4
TMB：2mg/ml溶于无水乙醇或者DMSO
H2O2: 30%

工作液：0.5ml TMB+ 9.5ml buffer+ 1ul H2O2
），
约10min后，目标条带出现黄色.不是出现蓝色吗？然后我用水漂洗结果条带消失。再显色就出不来了，请问原因是什么？
HRP最为灵敏的显色液是什么？哪个公司的比较好？
我的蛋白是70K左右，湿转条件你推荐是多少V多少时间？

============================

你这个配方不是沉淀型TMB的配方
怎么能把条带留在膜上啊？
需要用沉淀型的TMB
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3245

发表于 2013-3-9 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议：1.新配电泳液，转膜液，2.分子量较大，建议做6%(最佳分离浓度)的SDS胶，电泳时间80v浓缩胶， 120v分离胶,转膜基本可以，3.洗膜时间延长，一抗洗45分钟，3次，每次15分钟，二抗洗1小时，20分钟一次，洗三次，4.根据亮度调整曝光时间，胶片是用柯达的。我做的是125KD的，背景很亮。
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3246

发表于 2013-3-9 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜250mA时间30分钟左右，也可以转上，但效率比转膜条件150-180mA,30-40分钟，理论上差点，因为你的蛋白分子量小，只有33KD
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
3247

发表于 2013-3-9 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
肿瘤

==================================================================================

可能是配胶玻璃架插入电泳槽是，两边胶皮垫没卡紧，漏电泳液，或配胶玻璃间有缝隙，应该涂少许凡士林，

====================================================================================

是的，确实是这样，感谢。我现在在提取肿瘤组织蛋白，无论是怎么提取，始终没有发现蛋白，很是郁闷啊！

[ 本帖最后由 wmp1234 于 2013-3-9 15:52 编辑 ]


查看积分策略说明
附件
2013-3-9 15:52
46440584.snap.jpg (22.62 KB)
 
顶部
xueyouzhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76770
精华 0
积分 470
帖子 640
信誉分 100
可用分 3996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
3248

发表于 2013-3-9 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ你好，我最近做western遇到一个问题，转完膜之后，预染MARK在膜上看不到，胶上也没有。
我的一块，染了胶，发现还有条带，说明转膜不成功。
帮同学做的一块，染了胶，没有条带，他后续做了一抗二抗ECL等工作，阳性对照是有的。
我要检测的蛋白是30-50KD，转膜时间90min,恒流300mA。同学检测的是20左右。
我想问一下，是不是因为我的膜比同学的膜小很多，面积不同，造成不能用同一电流条件做呢？
昨天又做了一次，因为我只有5个孔道，带MARK，为了不浪费膜，只取了25-75kd区段，所以膜也剪得很小。转膜条件 300mA 100min。染了转过的胶，有一些若有似无的条带。我还有必要做下去么？谢谢！
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3249

发表于 2013-3-9 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xueyouzhang 于 2013-3-9 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

LZ你好，我最近做western遇到一个问题，转完膜之后，预染MARK在膜上看不到，胶上也没有。
我的一块，染了胶，发现还有条带，说明转膜不成功。
帮同学做的一块，染了胶，没有条带，他后续做了一抗二抗ECL等工作，阳性对照是有的。
我要检测 ...

电极放反？
顶部
xueyouzhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76770
精华 0
积分 470
帖子 640
信誉分 100
可用分 3996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
3250

发表于 2013-3-9 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电极放反？

========================

没有啊。有没有别的解释？
顶部
 6097  325/610 |‹‹‹323324325326327328329330331332›››|