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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-13 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以选择5-15%的梯度胶
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发表于 2013-3-13 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以选择5-15%的梯度胶

====================================================================

这种梯度胶可以直接用于分大分子量的蛋白，还是需要先将蛋白裂解为亚基？谢谢老师。
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-3-13 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转完膜后，用立春红染色，有条带，加完一、二抗后，由于条带暗，所以用一抗过夜了，效果还行，但两个星期后重复实验，一抗过夜后，效果不好了，就连背景也很暗，应该怎么解决？
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发表于 2013-3-13 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问定位在内质网腔内，与内质网内膜相连的蛋白如何提取呢？我用RIPA buffer裂解细胞，然后14，,000cpm离心取上清，能得到吗？谢谢了
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发表于 2013-3-13 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图片由下往上分别是内参GAPDH、磷酸化目的蛋白（分子量90kDa左右）、总目的蛋白；左侧是8%分离胶，右边是10%分离胶，两张膜孵育的抗体、条件基本一样。
我是先孵育磷酸化蛋白然后洗脱掉再孵育总蛋白的，结果发现有两个问题：
1、8%胶的磷酸化蛋白两侧marker也会显影，而10%胶却很干净，一抗跟marker蛋白结合好像说不通。
2、总目的蛋白爆出n条带，而跟磷酸化蛋白相比，我怀疑最黑的那条可能还不是目的蛋白。因为磷酸化蛋白条带的背景是往上走，而总蛋白的杂带是往下走，两者的分子量不太一致。总蛋白的一抗是CST的兔单克隆抗体，说明书建议用5%脱脂奶粉稀释，1：1000，封闭我用的也是5%脱脂奶粉。是不是一抗浓度应该降低？

求高手解答，谢谢！

[ 本帖最后由 yapuyapu 于 2013-3-13 16:41 编辑 ]


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2013-3-13 16:41
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发表于 2013-3-13 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转完膜后，用立春红染色，有条带，加完一、二抗后，由于条带暗，所以用一抗过夜了，效果还行，但两个星期后重复实验，一抗过夜后，效果不好了，就连背景也很暗，应该怎么解决？

======================

考虑下样品及缓冲液问题
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发表于 2013-3-13 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问定位在内质网腔内，与内质网内膜相连的蛋白如何提取呢？我用RIPA buffer裂解细胞，然后14，,000cpm离心取上清，能得到吗？谢谢了

===========================

可以用质量好的RIPA来裂解细胞
能得到内质网内膜蛋白
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发表于 2013-3-13 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yapuyapu 于 2013-3-13 16:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

图片由下往上分别是内参GAPDH、磷酸化目的蛋白（分子量90kDa左右）、总目的蛋白；左侧是8%分离胶，右边是10%分离胶，两张膜孵育的抗体、条件基本一样。
我是先孵育磷酸化蛋白然后洗脱掉再孵育总蛋白的，结果发现有两个问题：
1、8 ...


1、CST的抗体怎么推荐用5%脱脂奶粉呢？应该是BSA，你再看看说明书
2、CST的抗体有很多也不好用
3、总蛋白把抗体稀释度加大至1:2000,1:4000试试
4、你的WB做的还不错
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发表于 2013-3-13 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、CST的抗体怎么推荐用5%脱脂奶粉呢？应该是BSA，你再看看说明书
2、CST的抗体有很多也不好用
3、总蛋白把抗体稀释度加大至1:2000,1:4000试试
4、你的WB做的还不错

==============================================================================================================

谢谢楼主！

没错，说明书是建议用5%的脱脂奶粉稀释的。本来还想着掺杂5%BSA来稀释一抗的，但还是先从稀释一抗着手。
昨天将膜洗脱后，从中间剪成两半，分别孵育1:2000和1:3000两个浓度，结果看来改善很多了，如下图。对于1:2000居然比1:3000淡，估计是配制一抗时或二抗出问题（二抗也是分开孵的）。


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发表于 2013-3-13 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，我做western快两个月了，连内参都不出，请您帮我看看有什么问题
1，蛋白是一瓶细胞加300微升蛋白裂解液 RIPA裂解液(强），没有测浓度，因为紫外光度仪坏了。10微升加2.5的5乘蛋白loading煮沸后上样
2,10%分离胶，5%浓缩胶，80V跑浓缩胶，120V跑分离胶至溴酚蓝到底
3，半干转BIO的100毫安恒流1小时，丽春红染膜在最下面能看到清晰地一条带，往上就是很模糊了，感觉应该是转上了，（转完的胶考染能看到部分大分子的条带）。
4,5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（3年前的，最近没人用过）1；1000孵育1小时，TBST洗膜3*15min，2抗1；2000孵育2小时，TBST洗膜3*15min
5，暗室里加1毫升ECL混合液（康为世纪），关灯大约5分钟后可见大半个膜的地方都发出淡淡的荧光，用枪吸取ECL液体，保鲜膜包起来放入暗合，压片3分钟，什么都没有
请您帮我看看整个步骤问题到底出在哪，多谢了
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