小中大我将X基因分别构建在Invitrogen的pcDNA3.1，还有一个是带Myc标签的，两个载体。
蛋白30kd（分泌蛋白），买的伯乐的胶，配12%的，跑得很开了。伯乐的膜，孔径0.2um转膜350mA，90min(也试过40V，8h，差不
多)。转膜液配方：14.4g Glycine，3g Tris，200ml甲醇。室温用5%脱脂牛奶PBST封闭1h。
一抗(特异抗体购自R&D的和Myc标签抗体购自Invitrogen)6h，洗4*10min；二抗(Santa)3h，洗4*10min。
现在的问题是：
1. 需要很大的上样量（>100ug，用伯乐的染液Bradford测的），少了带出不来
2. 只有表达量很高（瞬转蛋白）的时候才能出带（但效果很好，带很清晰）
3. 试过一抗孵育室温2h，带出不来
4. 都说带标签的western会比较好做，但我做的效果甚至不如特异抗体
5. 好像大家做β-actin的时候一抗室温一个小时，压片的时候5秒钟之内就有很强的带，而我的一般需约1min
怀疑过HRP显色底物，但和别人的比较过，虽然我们的出来没背景带稍弱，但用他们的试了下，有背景也没带。
请问楼主：问题在哪里？该如何改进，才能提高体系的灵敏度啊？
fangweibin119 wrote:
1、100ug蛋白上样量有点大了，一般WB检测时10-20ug总蛋白
2、一抗最好孵育过夜
3、有可能标签抗体不好，或者转染没成功？这几天我在做真核转染的标签IP，效果还不错。如果需要，我可以给你点阳性对照样品（真核或者原核）及想对应的抗体做个对照
4、你的二抗与ECL用的是哪里的？
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谢谢你好意，不过我的阳性对照能做的出来，就是需要大量的样品和长时间的抗体孵育， 所以我怀疑wb系统的某个或某几个因素导致灵敏度太低。如何能在更少上样量（如30ug），抗体孵育时间更短的情况下把目的条带做出来？ 这就是我想要解决的。
我的二抗是santa c.的， 有驴抗羊，和羊抗鼠的。 ECL是伯乐的。
