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标题:【讨论帖】western blot问题解答

abc816[使用道具]
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发表于 2013-3-14 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我没碰到过这样的问题
看看膜是不是过期

=======================================================================================

谢谢老师的回答。师姐说她以前也碰到过几次做出这种结果的情况，也不知道什么原因，后来又没有出现过了。
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发表于 2013-3-14 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问250kd的蛋白，转膜条件是什么？ 湿转和干转是什么概念？我用的是1Xtansfer buffer，然后胶完全泡在BUFFER里面转膜，是不是湿转？谢谢~

===============

湿转
300mA 恒流
2h30min足够了
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发表于 2013-3-14 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果样品讲解的话一般是因为什么原因呢？样品降解了有什么特征？谢谢啦~

==============================================

如果是用WB的话
会出现多条带（与未降解样品对照，需要有对照做对比）
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发表于 2013-3-14 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢你好意，不过我的阳性对照能做的出来，就是需要大量的样品和长时间的抗体孵育， 所以我怀疑wb系统的某个或某几个因素导致灵敏度太低。如何能在更少上样量（如30ug），抗体孵育时间更短的情况下把目的条带做出来？ 这就是我想要解决的。

我的二抗是santa c.的， 有驴抗羊，和羊抗鼠的。 ECL是伯乐的。

===============================

一抗稀释度多少？可以改变一下试试
另外一抗是否孵育过夜？
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-3-14 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
湿转
300mA 恒流
2h30min足够了

=================================================================================================

谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的胶或者其他什么浓度的胶比较好？
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发表于 2013-3-14 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 abc816 于 2013-3-14 12:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
湿转
300mA 恒流
2h30min足够了

=================================================================================================

谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的 ...

7.5%或者8%就可以
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-3-14 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我是新手，请教一些问题！

1，我现在正做目标蛋白，显影时加发光剂能发亮，但是将胶片放入显影夜时胶片就变成了黑色，看不到条带。但是暗夹里的目标蛋白一直在亮，没有淬灭。现了好几次胶片都是黑板，这是怎么回事呢？

2，做内参时，也是在显影液中随着条带的出现胶片就逐渐变黑，将胶片放入定影液也没什么作用，作出的背景特别黑。只有几个胶片背景不黑，这是怎么回事。也红外线有关系吗，还是胶片或显影液的问题。但是以前师兄师姐做事条件相同也没有这样的情况？

3，定影液的作用是什么，能让背景变淡吗，怎么每次把胶片放入时条带都会变粗呢？

谢谢啊！！
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发表于 2013-3-15 10:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
300mA 恒流
2h30min足够了

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谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的胶或者其他什么浓度的胶比较好？
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发表于 2013-3-15 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的胶或者其他什么浓度的胶比较好？

==================

7.5%或者8%就可以
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发表于 2013-3-15 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我是新手，请教一些问题！

1，我现在正做目标蛋白，显影时加发光剂能发亮，但是将胶片放入显影夜时胶片就变成了黑色，看不到条带。但是暗夹里的目标蛋白一直在亮，没有淬灭。现了好几次胶片都是黑板，这是怎么回事呢？

2，做内参时，也是在显影液中随着条带的出现胶片就逐渐变黑，将胶片放入定影液也没什么作用，作出的背景特别黑。只有几个胶片背景不黑，这是怎么回事。也红外线有关系吗，还是胶片或显影液的问题。但是以前师兄师姐做事条件相同也没有这样的情况？

3，定影液的作用是什么，能让背景变淡吗，怎么每次把胶片放入时条带都会变粗呢？

谢谢啊！！
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