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标题:【讨论帖】western blot问题解答

hold住[使用道具]
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发表于 2013-3-15 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我去年9月做的western,目的蛋白survivin,16.5KD,用ECL，在Las-4000 Luminescent image analyzer上显影观察的，目的蛋白显影非常好。当时沒做内参，观察完后放4度冰箱，PBST浸泡中。现时隔7月，重新把这个膜取出来，stripping buffer洗20分钟后，在以同法PBST洗涤，β－actin 一抗孵育，PBST洗涤，二抗孵育，洗涤，之后同法ECL后在Las-4000 Luminescent image analyzer上显影观察，发现什么东西也没有。
是膜防止时间太长，还是β－actin 一抗及二抗有问题，或是什么原因。
我不知道怎么办，现在写论文要用，难道重新做。
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发表于 2013-3-15 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜上蛋白本身的问题比较大
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发表于 2013-3-15 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你好，我最近做Western，要用没做过的抗羊二抗，不知道要用多大的稀释倍数，说明书上是写的稀释1000倍，我想问下能再加大稀释倍数吗？1：3000可以吗？
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发表于 2013-3-15 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你好，我最近做Western，要用没做过的抗羊二抗，不知道要用多大的稀释倍数，说明书上是写的稀释1000倍，我想问下能再加大稀释倍数吗？1：3000可以吗？

===============

做预实验看看
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发表于 2013-3-15 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教老师，我是WB新手，最近做了几次预实验，结果如下图，两张图都是同样的样本，一个杂带很明显但条带蛮漂亮的（左图，粗的是目的条带），一个杂带比较淡，但背景很深且条带貌似不怎么好(右图)。两张图除上样量不同外，其余条件均一样，请老师指点下一步该何去何从？还有哪张图比较好点儿？实在困惑不已啊~~~先谢了。


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发表于 2013-3-15 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，两次内参(actin)都没有出来，搞不清为什么
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发表于 2013-3-15 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 66小飞侠 于 2013-3-15 10:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教老师，我是WB新手，最近做了几次预实验，结果如下图，两张图都是同样的样本，一个杂带很明显但条带蛮漂亮的（左图，粗的是目的条带），一个杂带比较淡，但背景很深且条带貌似不怎么好(右图)。两张图除上样量不同外，其余条件均一样，请 ...

结果差别还是挺大的

一抗两张用的是相同条件吗？
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发表于 2013-3-15 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-3-15 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


结果差别还是挺大的

一抗两张用的是相同条件吗？

是的，两张除上样量不同外（右图上样量小些），其余条件都一样。

我还在摸索条件中，遇到这样的结果是在不知何去何从……
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发表于 2013-3-15 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 66小飞侠 于 2013-3-15 10:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


是的，两张除上样量不同外（右图上样量小些），其余条件都一样。

我还在摸索条件中，遇到这样的结果是在不知何去何从……

建议多做几遍

把条件弄熟悉了
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-3-15 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做小鼠肺组织的MAPK中的JNK,裂解用的是碧云天的western以及IP细胞裂解液，临用前加的PMSF，用玻璃匀浆器进行匀浆，上样量是60微克，一抗用的是Bioworld Technology的JNK1/2/3 (T178) pAb，一抗二抗用的是脱脂奶粉，以前可以做出来，现在却做不出来了，不知道问题出在了哪？请问楼主在做这些时需要注意什么？还有就是用的PMSF曾经在室温放过一个小时，在四度也放过一天吧，会对裂解有影响吗？
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