蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  354/610 |‹‹‹352353354355356357358359360361›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3531

发表于 2013-3-15 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 hold住 于 2013-3-15 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近做小鼠肺组织的MAPK中的JNK,裂解用的是碧云天的western以及IP细胞裂解液，临用前加的PMSF，用玻璃匀浆器进行匀浆，上样量是60微克，一抗用的是Bioworld Technology的JNK1/2/3 (T178) pAb，一抗二抗用的是脱脂奶粉，以前可以 ...


PMSF不是主要问题

抗体买回来保存多久了？

现在内参能做出来吗？
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3532

发表于 2013-3-15 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主的回答，抗体买回来三四个月吧，一直零下二十度冻存，内参没有做过呢。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3533

发表于 2013-3-15 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主的回答，抗体买回来三四个月吧，一直零下二十度冻存，内参没有做过呢。

=======================

新提取的样品先检测下内参
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
3534

发表于 2013-3-15 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做大鼠脑组织的NOS，分子量130KD左右，用的是12%分离胶，4%浓缩胶，80V跑到头。转膜是20%甲醛，200mA恒流湿转40分钟.5%脱脂奶粉封闭2H，然后孵育1，2抗。跑完膜marker很清楚，但是曝光看不到目标蛋白，而且背景比较亮，请问可能是什么原因？是我的操作条件有什么问题吗，我看前面楼主的回答说是要300mA，2H，是不是这样更好一点？另外分离胶和浓缩胶的浓度还需要调整吗？
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
3535

发表于 2013-3-15 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问Trans-SD 通用型半干转印电泳槽转膜一个3×1厘米的膜，蛋白是内参，36的。

一般要多久的时间？多少的电流？

我用的是0.01A，三个小时时膜上有marker，胶上也有。

转膜的最佳效果就是胶上刚好转没，而膜上很清吗？
顶部
911[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73229
精华 1
积分 523
帖子 682
信誉分 102
可用分 4276
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
3536

发表于 2013-3-15 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好楼主，我想问一下就是我做jnk。做了好几次都出不来条带只有背景色，把上样量从原先的40ug调到了80ug还是那样，我做的这个蛋白是两条带的，分子量好像为46，,54
顶部
911[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73229
精华 1
积分 523
帖子 682
信誉分 102
可用分 4276
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
3537

发表于 2013-3-15 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好楼主你能把你的游戏地址或者qq留下吗想请教你问题。我是个新手，因为实验时间紧迫很需要有人指点谢谢。
顶部
windy+++[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74130
精华 0
积分 490
帖子 720
信誉分 100
可用分 4343
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
3538

发表于 2013-3-15 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问半干转恒流前面有1.2毫安/平方厘米，如果有两张膜同时转的话，是两张膜的面积相加呢还是按最大的算？：

内参36KD,目的蛋白106KD,请问这两个每个要转多久呢按上面的电流量？：

没有染色直接曝光，请问转膜的最佳效果就是胶上没有而膜上很清楚吗：？
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3539

发表于 2013-3-15 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢NBA老师的帮助，现在终于把内参做出来了，接下来要做目的了，我要做的是P糖蛋白，今天我才发现原来以前我因为这个抗体的问题曾经在站内短信中咨询过您，现在还是有几个问题请教

1，P糖蛋白是一种跨膜蛋白，那提蛋白的时候是按常规方法还是特殊的呢，我用的是买的蛋白裂解液RIPA，说明书上说可以用来提膜蛋白，但是实验室老师建议收集细胞冰浴超声裂解，究竟应该怎样呢

2，我买的一抗是abcam的鼠单抗说明书上western稀释浓度1/20,是1:20的意思吗，那也太费抗体了吧

3，我内参的片子，前两个是同一样品，后两个是同一样品，为什么最后的条带比前面的弱呢
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3540

发表于 2013-3-15 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~


查看积分策略说明
附件
2013-3-15 10:44
16864698.snap.jpg (138.74 KB)
 
顶部
 6097  354/610 |‹‹‹352353354355356357358359360361›››|