蛋白质与蛋白组学

也就是说最好将膜剪开，分别孵育一抗，二抗吗？

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这样做可以，需要确保剪的没问题

也可以做完第一个蛋白后，用stripping洗后再做第二个蛋白

我们构建了一个定位载体，就是将基因和GFP融合，然后用烟草瞬时表达系统表达，后来用共聚焦显微镜观察，初步认为是胞间蛋白。另外，我们还构建了表达载体，带有6个HIS标签，western blot 时，我用一抗是HIS 抗体，二抗是辣根过氧化酶。western blot 的体系应该没有问题

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在确定你的WB体系没问题的情况下考虑His一抗，His一抗有些只能识别原核的

所以你可以订一支不同的一抗试用

把膜用TBST或者PBST洗后

再加ECL

ECL淬灭快的话：注意封闭液是否时间过长、抗体是否回收使用、膜是否碰到金属物质


ecl前有TBST洗的，封闭用了5%牛奶一小时，抗体是新配的，膜每次都是夹子从封闭袋里来来回回的，算金属吗？

另外同样的条件，就是一抗有回收，今天什么荧光都没有了，以前也出现过这情况。郁闷啊。

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问题应该就是回收一抗

请教老师：

现在在验证Y2H的诱饵蛋白在酵母中是否能够融合表达。做了两次，都只有空载的带（所以裂蛋白方法应该没有问题）。第一次上样15ul，曝了5分钟，只有空载的条带。第二次加大上样量，1.5的胶板上样40ul，曝光了8分钟，在72kd处隐约有很细的带，但空载泳道在此地方也有条断断续续隐约的条带，所以怀疑是非特异的，不是我的目的条带。

WB的条件是转膜100V 65min，5%脱脂奶粉封闭，一抗（myc-tag）1：1000，二抗1：10000。

下次准备提高下一抗稀释比例，再做看看。您觉得是WB的问题还是此基因在酵母中表达就不是很好，已经裂过三次蛋白了，每次表达量都不是很好。

谢谢`

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先调整一抗浓度试试

有没有裂解酵母后的SDS-PAGE染色图片？

谢谢您的回复，今天又跑了一次磷酸化的NF-kbp65，条带很浅，等定影时又没了，今天用TBST洗了三遍，没有什么背景，一抗过夜，二抗五十五分钟，我们是半干转，膜面积乘2除一千，恒流跑，跑了大概四十五分钟，唉，比较纠结。

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定影时又没有是啥意思？

荧光淬灭？