【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

langlang[使用道具]
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3591

发表于 2013-3-15 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师，你好，我刚做WB不久，现在做了内参都可以出来，但目的蛋白出不来，我做的蛋白是在核表达的，提取蛋白的时候，10cm的长满细胞的培养皿我只加了150ul的裂解液去提取蛋白，这样裂解液会不会太少了，导致核蛋白无法提取出来的问题？

NBA[使用道具]
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3592

发表于 2013-3-15 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 langlang 于 2013-3-15 12:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老师，你好，我刚做WB不久，现在做了内参都可以出来，但目的蛋白出不来，我做的蛋白是在核表达的，提取蛋白的时候，10cm的长满细胞的培养皿我只加了150ul的裂解液去提取蛋白，这样裂解液会不会太少了，导致核蛋白无法提取出来的问题？ ...

目的蛋白是什么？10cm直径培养皿加300ul裂解液比较合适

另外可以把细胞消化后，收集到ep管再进行蛋白抽提

tuuu2[使用道具]
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3593

发表于 2013-3-15 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的western中有一个指标是细胞膜蛋白，大小是67KD，不知道该用什么做内参，恳请指教啊，最好还能提供内参抗体的厂家

lixi559[使用道具]
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3594

发表于 2013-3-15 12:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好，新手，问题比较多，我想问下就是我们以前做WB上样量是40，用的是国外的Amersham ECL Plus? Western Blotting Detection Reagents的发光液，那时不管怎样，都可以做出来。现在换了普利莱的做不出来了，别的实验室也有做跟我们差不多的，但用普利莱的也能做出来，我们的默，曝光以后，什么也没有或者，条带特别模糊，但是曝光完后的膜在保鲜膜风干后就能看见条带，您认为这是怎么回事？用过TMB染膜，也可以看到条带，所以，我想知道是不是ECL的问题？谢谢您了。

NBA[使用道具]
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3595

发表于 2013-3-15 12:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

is2011[使用道具]
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3596

发表于 2013-3-15 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好，新手，检测hTERT蛋白，137kD。为了摸索western blot 条件。我选取了HELA细胞，HEK细胞，HL-60 作为阳性细胞。有文献报导证实的。

前面三次我的分离胶浓度为12.5%，1.5mA/每平方厘米；转膜时间1.5小时，转膜后胶上仍可见少量蛋白，但是mark已经转的可以了；一抗1：200

二抗1:4000

ECL曝光结果基本没有条带。

后来分离胶改为 7% ，2.5mA/每平方厘米转膜，时间2小时。mark就转的很漂亮了。结果出现四条条带，杂蛋白比目的蛋白还明显。但总体来说带条还是很淡的。

到底是我哪里出问题了啊。还有问题的关键是我测了PROTEIN a,和BMI-1 也是基本没有结果，是***作流程有什么问题吗

bamboo16[使用道具]
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3597

发表于 2013-3-15 12:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好！

我现在刚开始做WB,实验室买的是NC膜，一般来说NC膜用之前不用甲醇处理的，但是我的膜不用甲醇处理而直接浸泡与缓冲液中的话就死活转不过去，用甲醇处理后伯乐半干转系统15V定压，10分钟就转过了，因为预染marker已经转到最下层滤纸上了。请问该怎么处理

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3598

发表于 2013-3-15 14:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bamboo16 于 2013-3-15 12:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师您好！

我现在刚开始做WB,实验室买的是NC膜，一般来说NC膜用之前不用甲醇处理的，但是我的膜不用甲醇处理而直接浸泡与缓冲液中的话就死活转不过去，用甲醇处理后伯乐半干转系统15V定压，10分钟就转过了，因为预染marker已 ...

你们买的是PVDF膜吧

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3599

发表于 2013-3-15 14:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好，新手，检测hTERT蛋白，137kD。为了摸索western blot 条件。我选取了HELA细胞，HEK细胞，HL-60 作为阳性细胞。有文献报导证实的。

前面三次我的分离胶浓度为12.5%，1.5mA/每平方厘米；转膜时间1.5小时，转膜后胶上仍可见少量蛋白，但是mark已经转的可以了；一抗1：200

二抗1:4000

ECL曝光结果基本没有条带。

后来分离胶改为 7% ，2.5mA/每平方厘米转膜，时间2小时。mark就转的很漂亮了。结果出现四条条带，杂蛋白比目的蛋白还明显。但总体来说带条还是很淡的。

到底是我哪里出问题了啊。还有问题的关键是我测了PROTEIN a,和BMI-1 也是基本没有结果，是***作流程有什么问题吗

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一抗santa的？

8s5g[使用道具]
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发表于 2013-3-15 14:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师，请您帮忙看一下这个图是怎么回事儿
附件里的两张图一个是beta-actin,一个是我的目的蛋白。上样量是80ug。问题有二：1、不知道为什么beta-actin各上样孔之间会连在一起？而同在一块胶上跑出来的目的蛋白就是分开的。我用的是恒压60V跑5%的积层胶，用90V跑12%的分离胶。也注意了在37度约30min促凝后，让胶在室温冷却约40min。我是用的在鼎国昌盛买的5*的SDS上样缓冲液，是把他终体积到1*用的。2、我是同时跑的两块完全一样的胶，两个的加样量完全一致，样品也是相同的，可我的目的蛋白两个做出来结果却不太一致，这是为什么呢？尤其是第一个问题，请老师帮忙指点一下。我也问过师姐，她们也不知道原因。

开始的时候，我的内参老是出不来，考虑之前可能是因为我ECL发光剂用的量不够。现在是出来了，背景却比较高。我们实验室用的是3%的BSA封闭，我可以用1%BSA来配β-actin的封闭液不？

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