蛋白质与蛋白组学

湿转的条件？

恒流 300mA，30min

目的蛋白是什么？抗体是哪里的？

=============================================================================================================

对，是湿转，目的蛋白是claudin-1。invitrogen的抗体，说明书上建议1-2ug/ml稀释，我已经是超过最大量了。1:100稀释的，始终爆不出来。

咋不用抗体？

抗血清容易有杂带呢

====================================================================================

俺这个因为是自己实验室克隆出的片段，所以市面上没有相关的抗体。我用的是上届师兄制备的兔的抗血清。

1.首先要确定提取你的蛋白有没有问题，用考马斯亮蓝染胶看看。
2.我没看到你的转膜条件，也不明白半干转“ 10%gel 15min 12%gel 22min”是什么意思？

3.转膜后可以用丽春红染下膜，看看。而且我觉得marker在膜上未必是转过去了，就是你不转，你的放置一会，marker的颜色也有可能到膜上，而且你的胶上有，是不是转的不很完全呢

4.我也做过一个分泌蛋白，文献上没有查到做WB的，其他地方也没抗体，只有SANTA有,说是能做WB，但是我从来没有做出来过，呵呵，所以放弃了

============================================

转膜条件：半干转

10%的分离胶转15分钟

12%的分离胶转22分钟（比10%的胶相应延长7Min）

转膜条件：半干转

10%的分离胶转15分钟

12%的分离胶转22分钟（比10%的胶相应延长7Min）

===========================================================================================================


1.半干转多少电流、电压啊？

2.还有你的蛋白是分泌型的，蛋白主要分布在什么地方你查清楚没？比如分泌到血清中啊。我觉得这点比较重要。你提蛋白，做出内参很正常，但是你提的这些蛋白中是否含有你的目的蛋白，或者目的蛋白表达极其微弱呢

1.半干转多少电流、电压啊？

2.还有你的蛋白是分泌型的，蛋白主要分布在什么地方你查清楚没？比如分泌到血清中啊。我觉得这点比较重要。你提蛋白，做出内参很正常，但是你提的这些蛋白中是否含有你的目的蛋白，或者目的蛋白表达极其微弱呢

=============================================================================================================

不好意思 是我没说清楚
1.恒流：膜面积x1.0（mA/平方cm）

2.我用同款一抗做了同批组织石蜡切片的免疫荧光试验 有阳性组织细胞定位且有差异 说明此种分泌型蛋白在组织中有表达 没有完全分泌入血清

1、缺失的一般是20K的

2、从你的胶图来看，胶有问题

=============================================================================================================

我重新配置了我的溶液.tris hcl的PH也准确测量过了,试验用的水也换了,可是结果还是这样,完全没有改善,我在别的实验室用相同的配置溶液却能跑出来,考虑是试剂的问题,请问您这个可能是什么呢??谢谢

不好意思 是我没说清楚
1.恒流：膜面积x1.0（mA/平方cm）

2.我用同款一抗做了同批组织石蜡切片的免疫荧光试验 有阳性组织细胞定位且有差异 说明此种分泌型蛋白在组织中有表达 没有完全分泌入血清

==============================================================================================================

那我觉得是抗体的问题了，因为我记得WB的抗体是和线性表位上的抗原结合的（蛋白在loading buffer中煮就已经被切），而免疫荧光的不一定啦，可以是空间表位，也可以是线性表位，所以可能你免疫荧光做的出来，但不一定做的出WB来。