【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

6097 403/610 |‹‹‹401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

tangxin_80[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79896
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4621
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态离线

4021

发表于 2013-3-18 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主您好，关于wb条带曝光的几个问题想请教您，谢谢！

1、怎么用同一条带曝光分子量相同的两个蛋白：？（两个蛋白的一抗种属来源相同和不同两种情况）

：两个目的蛋白A和B的分子量相同，在先曝光A后，利用同一条带再去曝光B，应该如何操作？

2、第一次曝光不理想，如何用该条带再次曝光？（TBST洗20min后重新加发光液？tbst洗后从加一抗或二抗开始？重新孵抗体之前是否需要封闭？）

3、如果两个目的蛋白相隔很近，在一条条带上，是不是可以将两个一抗混合一起孵育，同时曝光？

谢谢！

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

4022

发表于 2013-3-18 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师你好！

最近做核蛋白，用的H3做内参，但是它的位置和上样缓冲液的蓝色在一起了，怎么办？
还有什么常用的核蛋白内参？
磷酸化蛋白洗膜后还能做出来么？因为有2个磷酸化位点

======================================

核蛋白内参很多，请参考文献

比如Lamin B，PCNA，等等

洗膜之后可能做出来，看敏感性及表达量

鲇鱼少爷[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 103465
精华 0
积分 161
帖子 81
信誉分 100
可用分 1111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态离线

4023

发表于 2013-3-18 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢老师。
最近两次电泳，我和同学的所有抗体包括内参都跑不出来，
抗体不是重复用，有什么原因啊，就在前一次的电泳结果都不错的。
急死了，谢谢@！

newway[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

4024

发表于 2013-3-18 12:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师：您好！下图是我做的PARP和tubulin，这两个蛋白以前做过，都做出来，但是最近不知为何出现这种情况？我的一抗和二抗及ECL都是CST的，实验条件都跟以前一样。一抗比例1：2000和1：1000（PARP)

===========================================================================

请问一下，你之前是怎么提取蛋白的？其具体操作步骤如何？是用核蛋白提取试剂盒提取的吗？

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

4025

发表于 2013-3-18 12:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢老师。
最近两次电泳，我和同学的所有抗体包括内参都跑不出来，
抗体不是重复用，有什么原因啊，就在前一次的电泳结果都不错的。
急死了，谢谢@！

================

注意所有的缓冲液

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

4026

发表于 2013-3-18 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问一下，你之前是怎么提取蛋白的？其具体操作步骤如何？是用核蛋白提取试剂盒提取的吗？

=====================================================================

在做配制做胞浆、胞核抽提试剂的时候分离过。提取的是胞核组分做的，PARP-1效果一般

tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态离线

4027

发表于 2013-3-18 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢楼主！但是只上样1微升会不会太小了？我蛋白的浓度在8.2ug/ul，我曾经一起做过1:30的稀释，条带看不清楚~~~多谢楼主的帮助！

duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态离线

4028

发表于 2013-3-18 12:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大家好，我是最近开始做WB实验的新手有几个问题请教大家：
提取组织蛋白，BCA检测将各组蛋白浓度是2ug/ul，上样量是20ul，目的蛋白约75kd，内参43kd，10%胶电泳60v 30min后100v 60min，湿法转膜300mA 70min后，丽春红染色有蛋白，5%牛奶TBST液封闭3h，TBST液洗膜5min*3次，一抗：abcom 1:1000 4度12h后，TBST液洗膜5min*3次后，二抗碧云天 1:1000 3h，洗膜5min*3次，曝光出现：目的蛋白只有一组显示明显的条带，二内参各个组的条带粗细不一，有一个组没有显示条带。

请教的问题有：1.提取的蛋白是存在问题？

2.蛋白浓度是不太低了？

3.电泳、转膜、封闭、结合抗体条件是否有问题？

附件

2013-3-18 12:34

45840474.jpg (4.42 KB)

2013-3-18 12:35

87767293.jpg (9.71 KB)

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

4029

发表于 2013-3-18 12:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢楼主！但是只上样1微升会不会太小了？我蛋白的浓度在8.2ug/ul，我曾经一起做过1:30的稀释，条带看不清楚~~~多谢楼主的帮助！

=========================

总蛋白上样量在20ug就足够了

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

4030

发表于 2013-3-18 12:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-3-18 12:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位大家好，我是最近开始做WB实验的新手有几个问题请教大家：
提取组织蛋白，BCA检测将各组蛋白浓度是2ug/ul，上样量是20ul，目的蛋白约75kd，内参43kd，10%胶电泳60v 30min后100v 60min，湿法转膜300mA 70min后，丽春红染色有蛋白，5% ...

1、提取应该问题不大

2、浓度不低，但是你的定量方法误差特别大，从内参就可以看出

3、从目的来看是有表达的，与之对应的内参强度也很大。所以还是与你提取样品的上样量有关

4、二抗室温孵育30-40min就足够了

6097 403/610 |‹‹‹401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 ›››|