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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-21 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，为什么我8%的分离胶老是不凝啊？有时候都等了一个多小时了还是凝的不好？APS是现配先用的。谢谢啊
现在温度低

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注意适当加大APS与TEMED的量
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发表于 2013-3-21 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，我想弱弱的问一句转膜是用恒压还是恒流好？怎样根据蛋白分子量选择电压或电流？不胜感激

====================

实验室或者个人的习惯
我们转膜习惯用恒流
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发表于 2013-3-21 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问封闭用BSA，需用无IgG的吗？

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这个没有讲究，除非某个指标有要求
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发表于 2013-3-21 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好,我是新手,现在想做一个大小为10KD的蛋白,用的胶浓度是15%,用80V电压跑两个小时,200mA电流转膜,一抗浓度是1:1000, 二抗浓度是1:10000. 但是一直都做不出来,连内参都没有出来,求解答.
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发表于 2013-3-21 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ritou1985 于 2013-3-21 10:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好,我是新手,现在想做一个大小为10KD的蛋白,用的胶浓度是15%,用80V电压跑两个小时,200mA电流转膜,一抗浓度是1:1000, 二抗浓度是1:10000. 但是一直都做不出来,连内参都没有出来,求解答. ...

先把内参折腾出来再说
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发表于 2013-3-21 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想请教哈 我跑的蛋白电泳MAKER亮度很弱是什么问题了 但是蛋白好像也跑得不是很开 是不是胶的问题很大啊 我按照分子克隆书上配置的 12%的分离胶 5#的浓缩胶
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发表于 2013-3-21 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

OP我最近做Western 目的蛋白的分子量为76KD 配10%的分离胶，5%的浓缩胶跑胶还是很顺利的，Marker（预染蛋白质分子量标准---碧云天公司的）的条带非常清楚，只是在转膜的时候遇到麻烦了，我用的0.45UM的PVDF膜，恒流250mA，时间90分钟，但转完的时候膜和胶都一片空白。Marker找不到了，我疑问了好几天，好几天的心血都白费了，请问我到底哪个环节错了呀？希望楼主给我参考参考，我将会不胜感激。
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发表于 2013-3-21 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我想问问，在做Western之前，提取蛋白样品时，将收的细胞放在-80度冰箱，等几天再定量可以吗？如果可以能放多久？蛋白样品在-20 度中能放多久？
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发表于 2013-3-21 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，请教一下：我前几天做WB还有结果，昨天把乙酸当甲醇配转膜缓冲液了，结果转膜不成功，今天注意了这个问题，结果marker还是没有怎么转过去，请问有什么情况会导致这种结果啊？谢谢
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发表于 2013-3-21 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用什么ECL？
100K以上蛋白就是很少啊
300mA，2h

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版主您好，我用的ECL是碧云天的ECL Plus，前两天做的时候靶蛋白直接压片过夜了，第二天早上显影后条带还很暗，而且背景深。请教一下，300mA转膜2h后43kD的内参会转走吗？0.45的PVDF，谢谢您的解答！
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