小中大有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答
希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些
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楼主你好。我做WB也有几个月了，是我师姐没做出来遗留给我的，蛋白分子量是84KD的，文献上说也有110多，90多。60多，50多KD的前体蛋白及裂解蛋白，但主带应是84左右。先用RD公司的，做的是肺癌组织，没有结果，
后换成santa的，在55KD左右显示清晰条带，反复做几组蛋白，都是在55KD左右，而且癌组织和配对的正常肺组织之间没有趋势，甚至正常组织表达高于癌组织，这与预期结果完全相反。
条件：8-10%的浓缩胶，4%分离胶，电泳恒压80伏，至浓缩胶后改为105伏左右，转膜条件为55伏-60伏，2小时，5%脱脂奶粉封闭1小时，一抗4度过夜，1:500-1000，二抗室温2小时，1:5000-10000，ECL显像，所有中间步骤都是TBST洗10min,3次。
santa说明书上印着很清楚的带，84KD,是用hela细胞做的，后找来hela细胞做，始终不出结果，看到有人用胰腺癌细胞做过，显出110、84、55等多条条带，也用的同一种抗体，所以也找来胰腺癌细胞做，但是仍然没有结果。
后来又换成sigma抗体，新的发光液，条件同上，结果差不多也在55KD 左右，sigma的说明书上也说主带在84，有110多的，也可降解为50KD 及30多KD左右的。现在迷茫了，不知道问题出来哪里，这个始终出来的50-55KD蛋白是什么？是不是降解的目的蛋白？要是是的话为什么总是正常组织高于癌组织？为什么细胞总是做不出结果？这个问题怎么解决？
整个过程中，做内参GAPDH总能恒定的出结果。
期待答复，谢谢
