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标题:【讨论帖】western blot问题解答

fox_79[使用道具]
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发表于 2013-3-26 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳液不用调PH,转膜液才需要调PH到8.3

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转膜液不用调PH吧？
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2013-3-26 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜液不用调PH吧？

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我们实验室的是电泳液不调PH,一般要求电泳液PH在8以上就可以，配完后基本就满足这个条件了，转膜液要调到8.3
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发表于 2013-3-26 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢楼主的无私付出，再次请教问题
我要跑一个分子量14kDa的蛋白 15%的胶跑 用0.22的膜转 可是一抗1:8000 二抗1:50000 能看到条带 背景仍很张 二抗再稀释的话 就会暴不出条带来 请问可能的原因？
您说 我能不能用0.45的膜转 会不会好一点？ 您有没有这方面的经验可以传授？
万分感谢！

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用0.22um的膜
你用的是Millipore的0.22um PVDF膜吗？
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发表于 2013-3-26 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有用丽春红染膜，这个，难道WB不能通过预染marker的转膜的情况来判断转膜的程度么?
我先查查去。

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不能用预染marker来判断
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发表于 2013-3-26 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢前辈在百忙之中的解答，我的ECL买的是碧云天的，最近跑了三次western，内参都跑出来了，一抗1：200，二抗改为1：10000后没有目的条带出现，今天又用了1：7500的二抗，内参很好，背景不是很高，但目的蛋白的背景有些花，隐约可以看到目地条带，是不是一抗浓度太高了，一抗是STAN公司的，说明书建议1：100-1：1000，我又怕一抗二抗稀释的浓度太低目的蛋白曝不出来，我该怎么办内前辈。

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一抗本身的问题造成的
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发表于 2013-3-26 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
货号：Anti-Caspase 3 antibody [E87] (ab32351)
“This antibody is specific for the pro form and the p17 cleaved form of human Capase 3.”
难道我们买的抗体不对？

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cleaved片段不太好做
pro form 应该可以检测到
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发表于 2013-3-26 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我正好昨天刚配完电泳液，这是我们实验室的配方
10 X 电泳液
Glycine 144g
tris 30g
SDS 10g
加水至1L

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转膜后，膜染色了吗？
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发表于 2013-3-26 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜液不用调PH吧？

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电泳，转膜缓冲液都不需要调pH
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发表于 2013-3-26 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
cleaved片段不太好做
pro form 应该可以检测到

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做了蛮长时间了都没出，都快愁死了，不知道提高一抗浓度和加大上样量会不会出，如果不行就真不知道咋办了
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发表于 2013-3-26 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lgm 于 2013-3-26 13:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
cleaved片段不太好做
pro form 应该可以检测到

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做了蛮长时间了都没出，都快愁死了，不知道提高一抗浓度和加大上样量会不会 ...

一抗不同浓度你还没试？
先试试吧
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