蛋白质与蛋白组学

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

===============

上样量好大啊！

我做的是大鼠脊髓挫伤，检测caspase-3的WB,摸一抗，二抗浓度，做了好几个月也没出结果，一抗是Santa的，技术应该是没什么问题，现在可以把 内参显得很漂亮，就是不出目的条带，强烈怀疑santa的抗体不稳定（在论坛上也听到sabta抗体不好用的声音），我们是90次，300多元钱的，建议xdjm,如果实在不出结果，应该考虑下抗体的稳定性，不要为省钱买太便宜的抗体，否则费时费力！

=========================================

同感！用进口分装的一抗，浪费了一个多月的时间！

好，刚开始做WB，先开始跑内参，开始没有条带出来，最近两次做出来均在action位置出现3-4个条带，一条一条的，
背景很干净，我是从组织提的全蛋白，上样量150ug，90v，110v电泳，300mA 70分钟湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，
一抗 1：1000TBST稀释4°C孵过夜，国产二抗1：1000TBST稀释室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。DAB液显色，
是我的action抗体有问题吗？还有想问一下：一抗和二抗可以回收4℃保存继续用吗？十分感谢，救救我吧，
做了半个月内参都没做出来的。都快疯了

===============

1、上样量太大
2、有图片吗？

您好，老师
兔二抗用1:50000做某个指标可以做出很好的结果，有条带无背景。换做另外一个指标，仍然是用兔二抗，结果ECL发光时整张膜发亮，这样肯定是曝不出光，是不是应该降低一抗的浓度？需要针对这个指标调整二抗的浓度吗？

===============

不需要调整二抗浓度
调整一抗的试试

谢谢老师的回复，我们实验室所用的抗兔与抗鼠的二抗对WB的推荐浓度都是1：10000——1：200000，我不大明白怎样确定二抗的稀释度。
什么是点杂交？
还有如果先确定二抗的稀释度的话，一抗浓度应该怎样的？或者是我理解错了，您说的意思是：确定二抗稀释度的过程不需要转膜、封闭、加一抗的前步骤？
这个暑假憋在实验室很痛苦，像没头苍蝇似的在调浓度，看到您的这个帖子，像是抓到了救命稻草似的。谢谢您，望指教。

=============================

把二抗按照不同的稀释度稀释好后
取1ul点在NC膜上
等干燥后
加ECL发光，曝光

是在wb最后一步显影的时候，请问是怎么回事呢？（我附了一张显影的图片）

====================

这是彩色图片吗？
还是CCD照相的结果？

最近做WB 遇到以下几个问题，望老师指点：
1.浓缩胶花了45min不凝（有一个槽的胶没了，其他槽都凝的很好，所以损失了一个槽）
2。显影出来结果有两个条带是变形的，其他都好
3.显影出来有白色片状斑块，估计是气泡所致，如何可以避免
4。有张膜显影时间很长，也没将全部条带显出来，只有部分，是上样量是15微克，是上样量太少了吗？还是抗体浓度太小了？
5。只做标准曲线调蛋白时，曲线老是个指数曲线，弯的，浓度时0,1,2,4,8,16，这样回归系数太小了，怎么样改善呢，或者这样下去对所调蛋白浓度一致性的影响大不大，可以这么做吗？
多谢！

=====================================================

调整APS与TEMED的量（最大的可能性是APS失效了，重新配制）
有两个条带变形：应该是胶孔的问题
气泡要赶干净，没有别的方法
浓度0,1,2，。。。。这个浓度单位是多少？

最近准备跑WB，看了一些文献，发现一些问题请请教。
为什么说两种种属来源不同的抗体可以同时孵育?另外请看下图

文章中2个不同种属来源的一抗是混在一起同时孵育的，那么他们2抗之间用了“或”这个字眼是什么意思？也是同时孵育？还是其他什么方法？

请指教。

=============================

这个只是论文中实验方法的描述
不够详细吧

你好，我想 请教一下能否用牛奶封闭过夜啊？我用牛奶封闭过夜后，曝光的时候发现孵育了发光液后膜上没有一点发光的地方，不知道是不是因为牛奶封闭的太死了，可以加QQ2545597724聊吗

===============

你做什么指标？
内参？

调整APS与TEMED的量（最大的可能性是APS失效了，重新配制）
有两个条带变形：应该是胶孔的问题
气泡要赶干净，没有别的方法
浓度0,1,2，。。。。这个浓度单位是多少？

==========================================================================

谢谢您的答复！

1.昨天又做了，胶没出现那种状况，都凝的很好，老师分析的很有道理，我以后注意点量的问题。

2.两个条带变形，看图，如下：（这是GAPDH图）

3.通常PVDF用甲醇激活要激活多久啊，激活后需要再用转膜液洗吗？不知道气泡多和这有没有关系。

4.单位是微克/微升