【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

6097 521/610 |‹‹‹519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

5201

发表于 2013-3-28 12:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2013-3-28 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
调整APS与TEMED的量（最大的可能性是APS失效了，重新配制）
有两个条带变形：应该是胶孔的问题
气泡要赶干净，没有别的方法
浓度0,1,2，。。。。这个浓度单位是多少？

========================================================= ...

1、你说的这个单位是错的
2、中间两个条带的带型是由于胶的原因引起的

HPLC使者[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76541
精华 0
积分 250
帖子 260
信誉分 100
可用分 2011
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

5202

发表于 2013-3-28 12:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、你说的这个单位是错的
2、中间两个条带的带型是由于胶的原因引起的

===========================================================

谢谢您的关注！单位是微克/微升，也就是毫克/毫升啊，应该没错吧。。。

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

5203

发表于 2013-3-28 12:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 HPLC使者 于 2013-3-28 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、你说的这个单位是错的
2、中间两个条带的带型是由于胶的原因引起的

===========================================================

谢谢您的关注！单位是微克/微升，也就是毫克/毫升啊，应该没错吧。。。 ...

单位有误

HPLC使者[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76541
精华 0
积分 250
帖子 260
信誉分 100
可用分 2011
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

5204

发表于 2013-3-28 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-28 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

单位有误

那单位应该是多少呢？我用BSA配的，称取32微克BSA,用三蒸水溶解，震荡，离心得32微克/微升的BSA溶液，再倍比稀释得，16,8,4,2,1（ug/ul,即mg/ml）的BSA液，再加一个单纯三蒸水的0，作为空白对照，我不知道这样做对不对，不知道正确的单位应该是什么，老师能告诉我吗？

彼岸花opp[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 78567
精华 0
积分 221
帖子 162
信誉分 100
可用分 1576
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-30
状态离线

5205

发表于 2013-3-28 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师你好，我在预实验的时候用完成了如下一个结果，30μg蛋白的上样量，BSA封闭RT 1H,1:500的abcam一抗，1:10000的碧云天二抗，一抗孵育过夜，二抗RT 1H52KDa蛋白300mA恒流转膜75min左右,电压在75V左右，一抗和二抗出来后，0.1%TBST漂洗7到8次，每次7min左右

附件

2013-3-28 12:50

60884441.snap.jpg (17.48 KB)

彼岸花opp[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 78567
精华 0
积分 221
帖子 162
信誉分 100
可用分 1576
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-30
状态离线

5206

发表于 2013-3-28 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但在正式实验时却怎么也重复不出这个结果。现在这个结果如下：

条件是用了40μg混样蛋白上样量，一抗浓度没变，二抗前四个是1:20000的，后四个是1:10000的，封闭同样，一抗二抗孵育 RT 1H,100V恒压转膜75min左右，电流在270mA左右，洗涤同样, 压片7min

我的问题是：1.为何条带怎么都做不出像预实验那种又粗又黑的条带？包括孵育过夜我之前也试过
2.同样浓度，背景怎么差异这么大？应当如何改进呢?

谢谢老师！

附件

2013-3-28 12:51

35783012.snap.jpg (21.23 KB)

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

5207

发表于 2013-3-28 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那单位应该是多少呢？我用BSA配的，称取32微克BSA,用三蒸水溶解，震荡，离心得32微克/微升的BSA溶液，再倍比稀释得，16,8,4,2,1（ug/ul,即mg/ml）的BSA液，再加一个单纯三蒸水的0，作为空白对照，我不知道这样做对不对，不知道正确的单位应该是什么，老师能告诉我吗？

================================

BCA的线性范围在2mg/ml以内
你说的32ug/ul换算后就是32mg/ml
后续的计算或者测试肯定是不准确的

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5

UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

5208

发表于 2013-3-28 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 彼岸花opp 于 2013-3-28 12:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
但在正式实验时却怎么也重复不出这个结果。现在这个结果如下：

条件是用了40μg混样蛋白上样量，一抗浓度没变，二抗前四个是1:20000的，后四个是1:10000的，封闭同样，一抗二抗孵育 RT 1H,100V恒压转膜75min左右，电流在270mA左 ...

二抗浓度减低

彼岸花opp[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 78567
精华 0
积分 221
帖子 162
信誉分 100
可用分 1576
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-30
状态离线

5209

发表于 2013-3-28 12:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二抗浓度减低

==============================================================================================================

问题是，我上图是1:10000的二抗，下图前四个也是1:10000的二抗，后四个是1:20000的二抗，但是背景差异都很大，而且下图始终无法达到上图的效果

其次，为何再也得不到如上图般又粗又黑成椭圆状的条带了？

HPLC使者[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76541
精华 0
积分 250
帖子 260
信誉分 100
可用分 2011
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

5210

发表于 2013-3-28 12:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

BCA的线性范围在2mg/ml以内
你说的32ug/ul换算后就是32mg/ml
后续的计算或者测试肯定是不准确的

==============================================================================================================

我做的蛋白通常都是10mg/ml左右，要是BSA线性范围这么低的话，我该咋办，换成别的什么做标准曲线呢？上次我做动物蛋白，裂解液和动物组织比例没做好，测出来的最低浓度是2点多，被老板批评了。。。她说通常要10mg/ml。

6097 521/610 |‹‹‹519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 ›››|