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标题:【讨论帖】western blot问题解答

yonger[使用道具]
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发表于 2013-3-28 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！我最近几次做的western 只有内参有条带，目的基因无条带，不知什么原因？望不吝赐教，多谢了！我去年做出来过，我做的事p-ERK,p-p38MAPK蛋白，分子量分别是42,44,43kD，机器曝光后，仅见有膜的影子，上面啥也没有，我用的事cell signaling 的磷酸化一抗，因为已经三次结果都这样了，所以想请教一下师兄，多谢了！
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发表于 2013-3-28 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，您好，我的目的蛋白为40kD的糖肽，我采用半干转膜，恒压，20V，20min，但是多次重复检测不到，请您指点
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-3-28 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大神好，我是个新手，想检测成纤维细胞在实验前后生成I型胶原蛋白的量的变化，我能用WB检测吗？有的说用PCR检测，有的说用WB。我该怎么设计实验，迷茫了，请大神指教
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-3-28 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，你好。我做了一批WB的结果，最近在用Image J 软件进行分析，在群里搜到了很多关于使用的帖子，有的是把所有条带放在一个矩形框内分析，cuturl('http://d.dxy.cn/preview/4259987') 有的又是把每一的条带放在不同的框内分析，cuturl('http://d.dxy.cn/preview/1523143')我有点迷茫啦。请版主指点迷津。
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831226[使用道具]
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发表于 2013-3-28 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求各位大神帮帮忙。最近在做western，做了三次一直都没有做出条带来 。

我的目的蛋白约66KD，12%SDS-PAGE跑胶以后用18v恒压转膜一个半小时。然后37℃，用5%脱脂奶粉封闭1小时。4℃过夜封闭。第二天加一抗37℃摇2h，二抗37℃摇1.5h。显色。（一抗，二抗都按1:5000稀释）

但是结果是膜非常干净，目的条带和杂带也没有。我的阳性对照也没有条带。

因为我是新手，自己也找不出原因，求各位大神帮帮忙。
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发表于 2013-3-28 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 831226 于 2013-3-28 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
求各位大神帮帮忙。最近在做western，做了三次一直都没有做出条带来 。

我的目的蛋白约66KD，12%SDS-PAGE跑胶以后用18v恒压转膜一个半小时。然后37℃，用5%脱脂奶粉封闭1小时。4℃过夜封闭。第二天加一抗37℃摇2h，二抗37℃ ...

你的试剂盒说明书上，12%的胶 适合跑大小为66kd的蛋白么？还有 我们一般孵一抗是4℃过夜
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-3-28 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求各位大神帮帮忙。最近在做western，做了三次一直都没有做出条带来 。

我的目的蛋白约66KD，12%SDS-PAGE跑胶以后用18v恒压转膜一个半小时。然后37℃，用5%脱脂奶粉封闭1小时。4℃过夜封闭。第二天加一抗37℃摇2h，二抗37℃摇1.5h。显色。（一抗，二抗都按1:5000稀释）

但是结果是膜非常干净，目的条带和杂带也没有。我的阳性对照也没有条带。

因为我是新手，自己也找不出原因，求各位大神帮帮忙。

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还有抗体稀释的问题，如果前几次按同样的稀释比例都没有的话 可以考虑把滴度加大试试。
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发表于 2013-3-28 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有抗体稀释的问题，如果前几次按同样的稀释比例都没有的话 可以考虑把滴度加大试试。

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之前师兄也做过，是差不多大小的蛋白，也能做出来。我就是根据之前师兄的方法做的。我在想会不会封闭时间太长了？
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发表于 2013-3-28 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好~我想请教一下！我做的western内参很好，可是目的蛋白整条带都是荧光，尝试着降浓度什么的，都没效果，条带都看不清，要是降的很淡了还是看不清条带，谢谢~


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发表于 2013-3-28 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师好。我做WB也有几个月了，蛋白分子量是56KD的，，做的是肺癌组织，
条件：10%的浓缩胶，4%分离胶，电泳上层120伏，下层是180V。转膜条件为20伏，15分钟。5%脱脂奶粉封闭6小时，一抗4度过夜，1:2000，二抗室温1小时，1:2500，ECL显像，所有中间步骤都是TBST洗10min,3次。
显色很模糊，一团团的呀，总是这样的没有办法半定量。现在迷茫了，不知道问题出来哪里，期待答复，谢谢


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