蛋白质与蛋白组学

抗体说明书写：For western blots 1：1000, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS,
0.1% Tween-20
不明白到底怎么加。比如抗体1ul，那么 BSA？量， 1*TBS 1ml，0.1% Tween-20又是多少量？谢谢

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配好5% w/v BSA, 1X TBS 0.1% Tween-20
这个不会配制吗？

本人做蛋白已经有两个月了，但是一直没有把目的蛋白做出来，想请教群里面的高手，希望能帮帮小弟。我的目的蛋白是一个45kd大小的蛋白，是连接在pEGFP-N1载体上的，与标签蛋白EGFP属于融合表达，EGFP大小是27KD，所以我检测的蛋白大小应该就是72KD，我内参使用的ACTIN，大小为45KD。做了很多次了，一般都是内参一般比较清晰明显，但是目的基因要么条带很弱，要不就是杂带很多。
下面我说说我最近的一次实验的实验条件，我的浓缩胶的浓度是5%，分离胶的浓度是12%，膜是用的0.22的NC膜。转膜条件是：转膜液含有20%的甲醇，膜长6.5，宽3.2，转膜时间80min,电流大小为60mA,转后用TBST稍微洗了下，然后用5%的脱脂奶粉室温，最低转速，封闭2h .然后TBST: 3X5min,TBS :5min,一抗孵育：目的1：200，内参1：2000。4度过夜。次日洗膜：TBST: 3X5min,TBS :5min,。二抗孵育2h，目的和内参都是1：2000。洗膜TBST: 3X5min,TBS :5min.
结果，内参十分明显，暴光时间在2分左右，目的基因暴光时间在15分钟，且条带不是那种完整的直线，有些中间没有，感觉是孔的边缘还比较亮一点。
我问过我们实验室以前做过蛋白的师兄，师兄说可能是我转膜的时间太长了，但是我觉得目的蛋白72KD，内参45KD，如果时间长了，内参会比较浅才对的。还有的就是我的分离胶是用的12%的浓度，大了点，对于转膜的时候会产生很大的影响吗？

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WB系统有问题

老师，您好！我又来麻烦您了。我之前买的奶粉有问题，换了新的封闭效果很好，之前用5%BSA封闭摸出来上样量为15微克，换了4%奶粉封闭效果更好，但这次4块胶做下来，内参效果不错，但目的条带一张也没显出来，是不是还要摸下上样量？望老师指教！

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目的蛋白是？

封闭用过碧云天的封闭液，后来换成了5%脱脂奶粉（PBST配制），均为室温摇床1小时。另外抗体及稀释液均来自碧云天。（注，写出厂家，没别的意思，只是单纯的求助，请大家见谅，谢谢！）

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抗抗体试试吧

大家好，我最近在做western blot的时候问题如下：
我一般都是同时跑2块胶，一块做SDS-PAGE，另一块做western blot，
SDS-PAGE进过染色之后能很好的显示蛋白条带，western blot转膜之后，彩色的MARKER能很好的转上去，
然后5%脱脂奶粉封闭2小时，在一抗2小时或者4度过夜，在TBST洗3次，每次10min，再二抗2小时，TBST洗3次，每次10min，显影，曝光，就是什么都没有。
我将二抗直接放进显影液中，能发出亮光。将直接亮的，进行曝光，能显影。10×的TBS的PH在7.6。
基本证明我转膜和二抗是没有问题的，我想问下为什么显不出来，是什么原因。
万分感谢！

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转膜后用丽春红染色了吗？

老师您好！最近做WB又出现新问题，跑胶过程中marker分离到从上往下第4条，后面的条带没了，就这样一直跑到底，是不是我的胶做得不好，问题出在哪里，望老师指教，不甚感激……

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SDS-PAGE or pH

小鼠的FAT/CD36，分子量约为88

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条带的问题与SDS-PAGE配制中需要的缓冲液有关