小中大大家好,我是用的抗体是CST(9664)的cleaved caspase-3(17/19kD),没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3(35kD)
组织:新生6天SD大鼠脑海马组织的,提取的是全蛋白,储存-80的;
上样量:为60微克/lane;10%的胶(细胞色素C14kD跑出来了,但cleaved caspase-3没出来)
电泳参数:浓缩胶60v、30min,分离胶120v、60min;
转膜(半干转):恒流转,按照1mA/cm2(我同时跑的两块胶,胶总面积为16.6cm2,所以我转膜的电流为16mA),时间按照分子量定(1min/kD),选择了19min
封闭:5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗:5%脱脂牛奶稀释(1:1000),摇床上摇1h,4度过夜
二抗:5%脱脂牛奶稀释(1:2000),摇床上摇1h
洗膜:PBST洗10min*3遍
显色:ECL显色
注:1.同样的胶和转膜方法, 同时做的细胞色素C(14kD)就做出来了,不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的,不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来,
实验老是做不出来,也怕被怕被老板说,着急啊
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请问,我上面的步骤有问题吗?非常感谢~~~~
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新生6天SD大鼠脑海马组织为什么会表达cleaved caspase-3?有细胞凋亡吗?