蛋白质与蛋白组学

你好，我的一抗是Abcam的（ab74734，兔多抗whole serum），二抗Santa，内参博奥森的Beta-actin。目的和内参都做不出，很是着急，不知哪些环节可能有问题。
组织：人心肌组织，目的蛋白是膜蛋白，分子量97KD，用碧云天P0013裂解液提取全蛋白，测浓度20-30mg/ml。
上样量：20微升
电泳仪：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra
电泳：5%浓缩胶60v、30min，8%分离胶120v、60min（胶用考马斯亮蓝染色后，目的分子量周围条带清晰分明）
转膜：冰浴恒流300mA 60min（0.22的PDVF膜,1.5mm厚胶 转膜后染胶没有条带，染膜隐隐约约有，但不确定是不是）
封闭：碧云天封闭液室温封闭1小时
一抗：碧云天一抗稀释液稀释1:1000（说明书说1:300到1:4000），摇床上4度过夜
内参稀释1:1000（说明书1:1000到1:1500）
洗膜：TBST洗10min*3遍
二抗：碧云天二抗稀释液稀释1:2000，摇床上室温摇1h
洗膜：TBST洗10min*3遍
显色：ECL显色未见荧光，压片10分钟也什么都没有（稀释过的二抗直接加发光剂显影定影没有问题）

请问可能是哪些环节有问题？
1.组织在-80℃放了半年，有无影响？提取蛋白的方法有无问题，膜蛋白能用总蛋白做出来吗？
2.心肌组织是不是不能用Beta-actin作内参？
3.一抗-20℃放了4个月，期间一共就冻融过3次，会不会已经失效，如何验证？
4.转膜条件有无问题？转膜液配方：Tris 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，SDS 1g，加水至1000ml，有无问题？
5.Beta-actin和GAPDH 适合的转膜条件是多少？

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1、先检测内参吧，别折腾目的蛋白了。我看了下，这个蛋白做的人很少。
2、心肌组织我们不用actin做内参，我们用tubulin或者GAPDH
3、冻融3次，不会失效
4、转膜没问题，把SDS浓度调整到0.01%
5、湿转，恒流 300mA，30-50min

老师好，我又来提问啦，我做的是运动对骨骼肌信号通路的影响，运动刺激包括中等、大强度运动，最近我想把内参从beta-actin改成GAPDH，但我犹豫的一点是：GAPDH在肌肉中的表达量是否受运动影响？它是糖代谢中的一种关键酶，那我们的试验中，大鼠进行不同强度运动时，或多或少会影响到骨骼肌糖代谢，那么会影响到GAPDH的表达量吗？我担心，我的内参的不一致不是因为定量不均引起的，而会是运动强度引起的。

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可以用GAPDH或者beta-tubulin呢

老师你好，请问一抗可以重复使用么？可以的话最多使用几次？

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可以重复使用
但是具体重复几次不同抗体均不同，无任何参考

老师麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为115的磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的WB，一般是先显磷酸化蛋白，然后strip，重新封闭孵育抗体再显非磷酸化蛋白。步骤如下：
1.配制10%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.预电泳30V 10分钟，电泳时间先用60v的跑，待mark分开之后再用80v的跑个120分钟左右待溴酚蓝跑到底部。
3.再200mA转膜120分钟（恒流，冰浴）。最后一般mark也会转过来。
4.转膜后用5%的BSA四度封闭20小时左右（封闭时间略长应该没问题的吧）。
5.5%的BSA孵一抗1:1000（按cst推荐比例）过夜，TBST漂洗10min×3次
6.5%的BSA二抗浓度1：5000（按说明书），室温轻摇60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
9.然后strip6小时或过夜，重新用5％脱脂奶粉封闭，孵非磷酸化蛋白的一抗，再孵二抗显影。
0.45um的pvdf膜
最后的结果如图背景很深，做了几次都是这样，到底是什么原因呢，抗体都是只有一次的，都不敢回收用，全都买的cst的抗体

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二抗用1:10000

老师您好，我做WB转膜的时候经常碰到这种问题，Marker在跑电泳的时候都很正常，很直，但是转膜后却出现了问题，观察到的Maker转花掉了，然后上抗出现的就是这样的条带，我的转膜条件是300mA,1h
这个到底是什么问题呢！。我做WB失败的只有这一步了。。。。非常感谢

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有蛋白考马斯亮蓝染胶图吗？

1、内参条带如何？
2、目的蛋白的一抗孵育建议4度过夜

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内参条带很清楚，背景清晰。目的蛋白是4度过夜的。然后我又做了一个目的蛋白，46KD（内参43KD），有条带，很清 晰。但是之前的两个蛋白（一个71KD，一个68KD），都没有条带。