小中大楼主你好，我最近在做western-blot，样本是猪的肠道黏膜，现在有个220kDa大小的ZO-1蛋白一直没做出来，现将我的实验条件跟你说明一下，望楼主指点一下：
1、样品制备：裂解液配方50mM Tris-HCl 7.4，150mM NaCl，1% IGEPAL GA-360，0.5% Sodium dexycholate，0.5% SDS，10mM 焦磷酸钠，1% Triton-X 100，样品采集后于-80度保存，裂解时采用液氮研磨后以1：9比例加入裂解液（使用时加入PMSF和cocktail）于冰上裂解30min，期间进行旋涡振荡数次，12000r/min-4度离心，收集上清，分装保存于-80度冰箱，上样前调整蛋白浓度后，以1：4比例加入5X上样缓冲液95度-5min变性，上样量为20ug
2、电泳条件：8%分离胶-5%浓缩胶，80V-20min，120V-1h；转膜：冰上湿转200mA-2.5h，染胶后胶上已经看不到蛋白条带
3、封闭：3%BSA室温封闭1h
4、抗体：ZO-1（santa兔抗和羊抗）、zymed（兔抗），3%BSA稀释：1：1000、1：500，1：250（3种比例都尝试过），4度过夜；二抗（兔抗和羊抗）1：3000，3%BSA
图1
图1是三种抗体，不同裂解液裂解的样品：配为上述裂解液配方裂解，NP-40、中和弱为碧云天裂解液
zymed有淡淡的条带，但不在220kDa位置
图2
图2是采用zymed兔抗的结果，但条带依然不在220kDa位置
本人的疑问：
1、样品裂解问题：ZO-1属于外周膜蛋白，是不是样品裂解时间不够，还是裂解过了，ZO-1蛋白降解成亚基了，不是是没有裂解出来还是裂解过头了，
2，抗体问题：我这种裂解方法做其它蛋白都没问题，有100多kDa的也没问题，目前就这个蛋白很头大，以前我师妹做出来过一次（图3如下）
图3-santa兔抗
图4-zymed兔抗
样品是猪肠上皮细胞样，有进行超声（3s-10次-4度），而我也有作过一次超声裂解的，
如图5
现在真搞不清是什么问题，我师妹细胞样能做出来，但以前我的细胞样也没做出来过，还烦请楼主帮忙分析一下原因，谢谢
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ZO-1我也做过，没做出来
可能表达量小或者抗体没有特异性
