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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-4-3 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
发一张前一次的beta-actin和对应的目的蛋白的图吧，因为目的条带都是这样，因此昨天发的图那一次没做内参。
做了4张膜，跑的不同样品。上面一张孵的beta-actin，下面的是目的蛋白，如同昨天一样，显出的是白色条带……

==========================

目的蛋白的一抗浓度试了几个？
二抗与内参用的是相同的吗？
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发表于 2013-4-3 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、什么膜？是否正确处理了？
2、湿转还是半干转？
3、转膜条件？
4、如果半干转的话，可能电极板坏了

===========================================================================

nc膜，用之前先用转膜缓冲液浸泡15分钟
湿转，100v 1小时或200mA 2小时，两种转膜条件都试过，立春红染色条带总出现不规则的图案。
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发表于 2013-4-3 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

夹具和转膜装置都换了一套，仍然不理想，请老师帮忙分析下。
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发表于 2013-4-3 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
夹具和转膜装置都换了一套，仍然不理想，请老师帮忙分析下。

=========================

用的试剂是什么公司的？
原装还是分装？
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发表于 2013-4-3 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-4-3 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
夹具和转膜装置都换了一套，仍然不理想，请老师帮忙分析下。

=========================

用的试剂是什么公司的？
原装还是分装？

胶、电泳缓冲液、转膜缓冲液都是碧云天的，现配现用，仪器是北京六一的，膜记不清了，以前别人用完剩下的。
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发表于 2013-4-3 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近在做MMP-3，MMP-13，TIMP-1 western blot,做了五遍了，条带不特异，要不就是很淡，我用的是abcam的一抗，因细胞中蛋白浓度太低，蛋白上样15微克，用5%BSA的TBST稀释，4度过夜孵育，二抗1:5000，就是不出条带，请教是何原因，望不吝赐教，多谢了！附图如下：分别是：MMP3，MMP13，TIMP-1，ECL孵育2分钟，曝光时间3分钟，请较老师是否一抗稀释有问题？应如何调整？多谢了！


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发表于 2013-4-3 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶、电泳缓冲液、转膜缓冲液都是碧云天的，现配现用，仪器是北京六一的，膜记不清了，以前别人用完剩下的。

===================

用这些试剂的话
出现这种问题就正常了
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发表于 2013-4-3 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近在做MMP-3，MMP-13，TIMP-1 western blot,做了五遍了，条带不特异，要不就是很淡，我用的是abcam的一抗，因细胞中蛋白浓度太低，蛋白上样15微克，用5%BSA的TBST稀释，4度过夜孵育，二抗1:5000，就是不出条带，请教是何原因，望不吝赐教，多谢了！附图如下：分别是：MMP3，MMP13，TIMP-1，ECL孵育2分钟，曝光时间3分钟，请较老师是否一抗稀释有问题？应如何调整？多谢了

===================================================

1、二抗稀释度不合适
2、先确定二抗稀释度，再调整一抗稀释度
3、ECL用的是什么地方的？质量不好的ECL本身也会有自发荧光
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发表于 2013-4-3 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我现在需要做一个400kpa的大蛋白，请问我应该用多少浓度的分离胶
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发表于 2013-4-3 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师，您好！
我最近要检测小鼠脂肪组织中胰岛素受体的磷酸化水平（p-IR),可以直接做WB，还是需要先做IP把IR提出来之后再检测p-IR?另外，如果要先做IP，做到WB时要怎么进行定量？谢谢！
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