蛋白质与蛋白组学

请问:用6M(或4M,2M,1M)的盐酸胍洗涤包涵体,包涵体的量具体取好多啊?也就是说在提到包涵体之后,是直接取沉淀,用(多少?)盐酸胍洗?还是要先将沉淀用PBS溶解之后再用盐酸胍洗呢?很急!!!!请哪位高手指点一下!谢谢!!!!!

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包含体的克数称不准的，我们这里的电子天平没有那么准，相信多数电子天平都称不出准确的包含体的克数，因为得到的包含体毕竟太少了，呵呵。

得到包含体沉淀之后，首先要用洗涤液处理一下包含体（而不是PBS,如上面战友所说的哪样，PBS不能溶解包含体，洗涤还可以，但是不如正规的洗涤液效果好。)，这一步对于后续的纯化过程是非常重要的。然后直接在洗涤过后的沉淀中加入盐酸胍或尿素都可以将包含体溶解掉，但是最好在其中加入少量的还原剂如DTT。

知道那个GST有多少个二硫键在里面吗是不是一般接在GST后面的蛋白会形成包涵体表达主要不看目的分子大小，而主要在于二硫键的多少。tac启动子的不严密是不是在诱导剂浓度太高时会形成包涵体表达的原因之一呢？谢谢！

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这位战友问的很深，我也没太看懂，呵呵。但是我觉得我没有解决的这个问题水平，惭愧惭愧。

说说我的看法吧：

包涵体形成的因素有太多太多了，能想到的有：

1、在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
2、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
3、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
4、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
5、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
6、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
7、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。

但是没有想到的因素呢？也许你提到的也是一种可能吧，呵呵。期待有高手进来参与讨论，解决您的问题。

能降低包涵体形成的条件有：

1、降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。

2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。

3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

我也是在做用重组抗原作单抗，目的也是做诊断试剂盒，不过我是作动物上的。其实我也想过柱纯化可是老板不舍得买进口镍柱，所以我才很是郁闷，想通过别的办法纯化。我还想请教个问题：
SDS胶回收的蛋白还能通过除去SDS复性么？我同时作了几组免疫老鼠，有胶回收的蛋白，有剃度沉淀后最终溶到2M尿素里的，还有洗涤后的沉淀直接用PBS冲悬的，不知道我这几组都可行么？
还有，您刚说的 正规的洗涤液 指的是什么？PBS+TritonX100+低浓度尿素么？
看来以后要多在这里向大家请教了：）

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一根可重复使用的镍柱只需要400RMB，如果这点钱都舍不得花，那么做单抗后面还要花的更多的钱怎么办。

你的几种免疫方案都可以得到抗体，但是都是没有复性的抗原免疫的，那么产生的抗体肯定会跟天然的抗原产生的抗体有区别，因为抗体跟抗原的空间构象有很大关系，不复性恐怕不行，跟你老板商量商量吧。想做单抗是看重经济效益，但是有舍不得花本钱，太抠门了吧？

SDS胶回收的蛋白倒是能出去SDS复性，但是你靠胶回收得到的蛋白量也太少了，用这样的蛋白免疫动物太辛苦了。

我说到的洗涤液就是洗涤液1和2，配方如下:

洗涤液1：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 0.5% TritonX-100
洗涤液2：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 2M 尿素

洗涤之所以重要是由于包涵体中不仅仅有目的蛋白，还有差不多50％的其他成分，而用一些中性的去垢剂和低浓度的尿素能将其出去，提高蛋白纯度，为后续纯化减轻负担。