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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

yjf1026[使用道具]
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我这里还有个问题,就是我想用跑胶切胶的方法来纯化样品,那么切胶后,怎么样处理胶去注射兔子好呢?需要好多的胶量来注射?
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我这里还有个问题,就是我想用跑胶切胶的方法来纯化样品,那么切胶后,怎么样处理胶去注射兔子好呢?需要好多的胶量来注射?

=====================================================================================================

我们上面有位师兄,他就是切胶免疫的,具体做法有两种:

一个是首先跑两块胶,一块染色,一块不染,然后比对着将目的蛋白切下,然后放入PBS中,在40度左右的水浴中可以将其溶解。

还有一个就是跑一块胶,然后用1M的kcl浸泡,20min左右可见明显乳白色条带,然后将其切下,之后的步骤同上。

具体需要多少胶要根据你胶的上样量来定了,上样多就能多得到一些,上样少就得到的少了,呵呵,还跟你的蛋白的表达量有关。
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yjf1026[使用道具]
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哦,我明白了。其实我们实验室有人用过这种方法,但是大部分人是将胶磨碎之后再加水或是PBS溶解,然后注射兔子。
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yjf1026[使用道具]
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请问你们初次免疫后多久进行加强免疫呢?我看到分子克隆实验指南上说是一个月后,但是我们实验室的好多人都是在一周后就进行加强免疫,检测效价,这样能检测出来吗?
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请问你们初次免疫后多久进行加强免疫呢?我看到分子克隆实验指南上说是一个月后,但是我们实验室的好多人都是在一周后就进行加强免疫,检测效价,这样能检测出来吗?

==============================================================================================================

免疫间隔时间是重要因素,特别是首次与第二次之间更应注意。一个月之后有点长了,但是一个星期之后我觉得又有点短了。我认为应该这样:

第一次免疫后,因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段,如很快接着第二次注入抗原,极易造成免疫抑制。一般以间隔10~20天为好。二次以后每次的间隔一般为7~10天,不能太长,以防刺激变弱,抗体效价不高。

免疫抗原剂量:首次剂量为300~500μg,首次免疫用完全佐剂。加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每隔一段时间加强免疫一次,加强免疫时用不完全佐剂。

免疫方法我想应该用多点免疫,一来因为兔子较大,二来多点免疫的效果好。是在背部多点免疫,免疫了7、8个点。

第一次后测效价肯定不可行,至少要等一个月之后才能测效价,因为免疫后先出现的时IgM,IgM消失后出现的才时IgG。
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kuohao17[使用道具]
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8M尿素的配方是怎么样的?另外,洗涤液和溶解液的量是怎么确定的呢?还原剂的量加多少啊?
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请问,用8M尿素溶的包涵体以及除去尿素的包涵体溶在PBS里的,应该怎么保存?4度还是-20,蛋白是用来免疫的,要放1~2个月。反复冻融对免疫用的蛋白有影响么? 谢谢!~
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ukonptp[使用道具]
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8M尿素的配方是怎么样的?另外,洗涤液和溶解液的量是怎么确定的呢?还原剂的量加多少啊?

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配方的说法有很多种,我跟你说一下我们实验室的配方吧:

8M尿素:

urea:8M
Nacl:0.5M
Na2po4:20mM
nah2po4 :20mM
调PH值至7.4

PBS:

先配好溶液A和溶液B。

溶液A:0.2mol/LNaH2PO4(27.8g NaH2PO4;或者36.14g 2水合NaH2PO4O溶于1000ml水中)。

溶液B:0.2mol/LNa2HPO4(53.65g 7水合Na2HPO4或者71.7g 12水合Na2HPO4溶于1000ml水中)。

溶液A与B按下表比例混合后,用水稀释至终体积为200ml。

体积A(ml)---体积B(ml)---pH
87.7-------12.3------6.0
85.0-------15.0------6.1
81.5-------18.5------6.2
77.5-------22.5------6.3
73.5-------26.5------6.4
68.5-------31.5------6.5
62.5-------37.5------6.6
56.5-------43.5------6.7
51.0-------49.0------6.8
45.0-------55.0------6.9
39.0-------61.0------7.0
33.0-------67.0------7.1
28.0-------72.0------7.2
23.0-------77.0------7.3
19.0-------81.0------7.4
16.0-------84.0------7.5
13.0-------87.0------7.6
10.5-------89.5------7.7
8.5--------91.5------7.8
7.0--------93.0------7.9
5.3--------94.7------8.0

然后按所需PH值配制即可。
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ukonptp[使用道具]
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请问,用8M尿素溶的包涵体以及除去尿素的包涵体溶在PBS里的,应该怎么保存?4度还是-20,蛋白是用来免疫的,要放1~2个月。反复冻融对免疫用的蛋白有影响么? 谢谢!~

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反复冻融对蛋白的影响很大,建议你放在-80度的超低温冰箱里更保险一点,而且在存放之前最好能在里面加入一定比例的甘油,如20%,这样对于蛋白的稳定有很大的帮助。还有就是免疫前几天取出一点样品跑个page看一下蛋白是否已经降解。
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moonlight45[使用道具]
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我用小鼠来免疫,剂量大概是多少啊?
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