蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 moonlight45 于 2013-4-11 12:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用小鼠来免疫，剂量大概是多少啊？

如果是免疫小鼠的话，不论是用来制备单克隆抗体还是检测目的蛋白的抗原性都可以使用与制备单抗一样的免疫方案，当然如果免疫方法不同的话免疫剂量也会随之产生相应的变化。下面简单介绍一下腹腔免疫的免疫剂量：

首次免疫用50ug抗原（可溶性的）溶解于100或150ul的生理盐水或是PBS中然后加入等量的弗氏完全佐剂充分乳化后行小鼠腹腔注射。

两周后，用同样的剂量和同样的抗原行腹腔免疫。有的说这次免疫可以换为弗氏不完全佐剂，个人认为还是完全佐剂好。

三周后用50ug抗原溶解于100或150ul的生理盐水或是PBS中然后加入等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射。

两周后50－80ug的抗原加入生理盐水到200ul行腹腔注射，三天后尾静脉取血测效价确定下一步实验方案。
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：听说疏水填料能够在不去除盐酸胍的情况下纯化蛋白，请问大侠们，这种填料要用什么样的洗脱液洗脱蛋白？
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高盐上柱，低盐洗脱
这里的盐可以是NACL，一般为硫氨
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

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加入DTT试试，如果实在还是溶不了，试试提高尿素浓度到10M。
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jkobn[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
试试用6M盐酸胍溶解，效果可能会好一些。

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我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

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请试着将溶液置于37度水浴，因为尿素溶解会吸热
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。
本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只有之前的1/10，也就是说总得率变成了5％，损失的蛋白大部分都以沉淀出现。难道透析24小时都不算长吗？
郁闷死了，还没上柱样品就已经稀的要命，再用离子柱能纯化下来多少啊～
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发表于 2013-4-11 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-4-11 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 wsll 于 2013-4-11 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。

我作过，可以讨论一下，但不知道你复性的要求高不高，活性要达到多少单位？理论活性16.8，如果你要求很高，那真的要毕不了业了
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