蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

ukonptp[使用道具]
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非常感谢!
打算用您的方法试试,这样就可以大大的减轻工作量了。
还有想问一下,介绍这些蛋白质纯化方法包括透析有哪些书或资料可以参考?因为我们实验室以前没人做过这些,我想再仔细研究研究。谢谢

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这个不好说了,我是在一本叫做从纯化到星辰的书上面看到的。
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ukonptp[使用道具]
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昨天做了添加50%甘油的透析工作,遇到两个问题。
1、电泳有明显的拖带
2、透析后发觉样品液体量减少很明显,估计这也应该是影响带型的原因吧。
希望帮忙解答下。

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能否发张图来看看拖带到底多明显?你的意思好像是甘油导致了拖带是吗?那不可能,甘油绝对不会导致拖带的,肯定是其他原因,但是我不知道,建议你去SDS讨论帖问一下。

样品有点减少是正常的,我每次做都是减少40%左右,你的又是大概减少了多少呢?透析带绑紧没有??
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我预备用包涵体免疫小鼠,一共有三个方案:1:包涵体(未溶解)直接免疫2.用尿素溶解后跑胶然后切胶免疫3.将溶解后的包涵体复性再免疫.
问1:这样的方案是否可行.
问2:方案1中:洗涤并离心后的包涵体沉淀.我打算,用PBS先把沉淀充分悬浮,然后也佐剂混合,来免疫小鼠.不知道这样做可不可以?想知道各位老师是怎样做的.
盼复
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预备用包涵体免疫小鼠,一共有三个方案:1:包涵体(未溶解)直接免疫2.用尿素溶解后跑胶然后切胶免疫3.将溶解后的包涵体复性再免疫.
问1:这样的方案是否可行.
问2:方案1中:洗涤并离心后的包涵体沉淀.我打算,用PBS先把沉淀充分悬浮,然后也佐剂混合,来免疫小鼠.不知道这样做可不可以?想知道各位老师是怎样做的.
盼复

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回1:可行。我是做过你的方案1和3,没有做过切胶免疫,老板不让。而是做的包涵体直接溶解后没有复性的蛋白去免疫小鼠。

回2:可以。但是要注意量的问题,因为包涵体里面的蛋白浓度是很大的。如果免疫剂量太大的话,可能对动物产生影响,如发热等。但是对于效价有无影响我不知道。
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天蝎座[使用道具]
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,还有问题
请教各位老师:
我溶解包涵体的溶液:我的包涵体是在含8mol/L尿素的缓冲液A(50mmol/LTris-HCI;50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%)溶解的。
我的溶解蛋白是在加有1%的甘氨酸的2000ml缓冲液A(50mmol/LTris-HCI;50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%,ph值7.0)中进行透析复性的。

问题1:我现在还不知道这样做复性是否成功。所以请问;这样的溶解液和 这样的复性液是否是正确的搭配?有更好的搭配吗?
问题2:若按照我上一帖提出的方案二“将溶解后的包涵体跑SDS-PAGE胶做切胶免疫”,在跑胶前是否有必要把溶解的包涵体也透析一下(降低尿素的浓度)?
问题3:若按照我上一帖提出的方案三“复性的包涵体免疫”,在我用的这样的缓冲液内透析复性,是不是只要调好PH值保证我的蛋白样品不沉淀,就可以把透析复性袋中的蛋白溶液直接混合佐剂免疫老鼠了?
谢谢,请指教。
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ukonptp[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 天蝎座 于 2013-4-11 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
,还有问题
请教各位老师:
我溶解包涵体的溶液:我的包涵体是在含8mol/L尿素的缓冲液A(50mmol/LTris-HCI;50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%)溶解的。
我的溶解蛋白是在加有1%的甘氨酸的2000ml缓冲液A(50mmol/LTris-HCI;50m ...

我的8M的尿素配方是这样的:

urea:8M
Nacl:0.5M
Na2po4:20mM
nah2po4 :20mM
调PH值至7.4
我的透析体系是这样的:
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10%甘油
如果有条件加入1%的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽。
不知道你的包涵体溶解后还要不要纯化了,如果是的话,我觉得里面那个edta可能不太好,因为它可以影响蛋白与镍柱的结合。
复性跑胶后蛋白依然是变性的,所以切胶只能是切胶后复性或是不复性了。
透析前是要确定你的目的蛋白的等电点然后决定透析液的ph,以尽量避免目的蛋白发生沉淀。
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我之前就是用切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的小鼠,3免完了7天采血作ELISA(用切胶回收的蛋白包被的板子,血清只做到了1:80的稀释 ),测值后发现,只打了纯佐剂的小鼠 和免疫(蛋白加佐剂)小鼠 ,OD值竟然差不多,平均都在2.7以上,什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右。
请问各位,是不是我的ELISA作的有问题,还是血清稀释度不够,佐剂免疫小鼠的血清 怎么会和我切胶回收的包涵体蛋白结合呢?我现在觉得做了 1个多月的免疫好像又失败了,真的好痛苦啊,请大家帮忙分析一下吧~~
ps:虽然此帖不属于纯化复性,但是因为楼主说做过包涵体免疫,所以就把帖子发在这里了。先谢谢了~
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ukonptp[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 qqq111 于 2013-4-11 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我之前就是用切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的小鼠,3免完了7天采血作ELISA(用切胶回收的蛋白包被的板子,血清只做到了1:80的稀释 ),测值后发现,只打了纯佐剂的小鼠 和免疫(蛋白加佐剂)小鼠 ,OD值竟然差不多,平均 ...

这个问题我思考了很久,但是没有得出答案。

我想问一下你的蛋白是什么?因为我能想出的唯一的可能性就是因为完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌,会不会跟你的蛋白结合呢?其余的原因我真的想不出,理论上是不可能的,再有就是交叉污染了。不好意思。
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1. 什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右, 光从这点就可以看出你的ELISA是有问题的,本底太高。先解决你这个检测手段的问题。
2。只打了纯佐剂的小鼠 和免疫(蛋白加佐剂)小鼠 ,OD值竟然差不多。从这点又可以看出,你的免疫是完全失败的。你应该从根本入手,解决你的蛋白的活性问题。基于你已作过切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的实验(我一直对这种方法保留意见)。那么不妨尝试一下复性后免疫。
祝顺利。
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XYZQ[使用道具]
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请教一下:我现在用的是大肠杆菌表达体系,理论上应该得到RNaseA的包涵体,我现在应该用什么方式得到包涵体的粗提物呢?超声波还是溶菌酶?另外,经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析?如果可以的话,用什么溶液进行溶解呢?谢谢
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