小中大【求助】heLa细胞mTOR 分子的western blot
想检测hela细胞中mTOR 分子的表达和磷酸化情况,western blo实验做了3次,可是都没有目的条带,很是着急,还请各位帮我分析下啊~~
磷酸化的mTOR或许不好检测,可是我的mTOR的条带也没有,感觉就是很奇怪了。一抗说明书上显示mTOR 235KD, phospho-mTOR 289KD(说明书中phospho-mTOR是293细胞的,289kd,mTOR是大鼠肝脏中的,235kd,热心的iris_palm版主回帖说这个可能是由于组织特异性)
下面是我实验的具体步骤与试剂,各位大侠帮我分析下啊,不胜感激
1.mTOR的一抗是abcam公司的,phospho-mTOR的一抗是cell signaling公司的,二抗是荧光二抗。
2.实验步骤:
1) sample buffer 在60mm皿中裂解细胞,刮板将细胞刮下,吸到1.5ml EP
管,用1ml注射器枕头抽吸细胞,破碎DNA,沸水浴5min。-20度冰箱保存。
2) 电泳 浓缩胶4%,分离胶6%。先是50V跑过浓缩胶,130V电泳3h。上样量是200ug。
3)转膜 pvdf膜,100V,3.5h。
4)5%脱脂奶粉封闭2h。
5) 一抗用脱脂奶粉1:1000稀释4度过夜。PBST洗膜,3次每次5min
6)二抗脱脂奶粉1:5000稀释,室温1h。洗膜,4次,每次5min。
补充一下:
1.本人用的试剂药品荧光二抗之类的应该没有问题,前些天成功地检测到了AKT和phospho-AKT。
2.转膜时marker最大 175kd的,可以转过去的。
3.蛋白胶跑过了,考马斯亮蓝染过,有条带的。至于蛋白上样量,因为觉得这个蛋白的含量可能比较低,所以多加了些。我的蛋白浓度是用nanodrop的仪器测的,当然可能蛋白浓度不是很准,所以就有意多加了些。
4.阳性的话我也考虑过。mTOR的抗体是abcam公司的,推荐
rat liver lysate 做阳性对照,可是这个我没有,phospho-mTOR的抗体是cell
signaling 公司的,它的图是用293细胞饥饿16h做的,其中一张图是染的mTOR。我们实验室不做大鼠,所以我用293细胞,不加血清的DMEM培养基处理16h做的阳性对照,也是没有条带。不知这算不算是阳性对照呢??
5.其实也是看到一篇文章中用过这两个抗体才订的。那篇文章结果还可以的,是我们老板一年前在的实验室发的,所以方法什么的应该也没有太大关系,可是我做的就是没有条带,很是郁闷……
还有我想请教一下
1.转膜完了,胶用考马斯亮蓝染色,不管做哪个蛋白好像总是marker转的最彻底,这是什么原因呢??
2.关于蛋白样本的反复使用问题 我一直在想蛋白样品煮沸之后-20度保存的时候会不会也会使某些蛋白降解啊??即使分装开了,每次拿一管出来用,那剩余的样本即使没有反复冻融会不会也有可能降解掉??
再另:我们实验室几个月前有人买了santa cruze的抗体,wb做了好多次都没有条带,后来向一篇文章的作者要了他们自己做的抗体就染出条带了。联系代理公司又给他们换了一支新的抗体。我的抗体是不是会有问题啊??担心,大把的时间浪费在上面的>_<
附件照片是我的结果