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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 guagua 于 2013-6-28 13:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


谢谢解答！我还没有用过没预染的marker，请问原始marker如何在膜上看到条带呀？能否在这里给我们新手解释一下如何做？非常感谢！

所谓预染marker就是不需要染色，在电泳的过程中就能看清楚条带迁移，预染marker有个好处就是知道何时可以停电泳，而原始marker(就是非预染的）的只能凭经验停电泳了。
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bling[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主，可以将上样缓冲液中的各种成分的作用解释一下吗？还有我提取的蛋白大约1-5ug/ul，楼主建议一下用什么缓冲液上样呢？谢谢！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bling 于 2013-6-28 13:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主，可以将上样缓冲液中的各种成分的作用解释一下吗？还有我提取的蛋白大约1-5ug/ul，楼主建议一下用什么缓冲液上样呢？谢谢！

SDS：十二烷基磺酸钠，与蛋白结合后使蛋白所带的负电荷远远超过本身所带的电荷，每2个氨基酸结合一个SDS分子。SDS还可以破坏蛋白分子内的氢键。巯基乙醇：还原剂，还原蛋白质分子内的二硫键，和SDS共同作用让蛋白分子变性，成为结构松散的长链状。溴芬兰：指示剂，当电泳时溴芬兰跑到底时，电泳即可结束。甘油：主要作用加大缓冲液的密度，使样品不漂移串道。有些buffer里面用DDT作还原剂，甘油用蔗糖来替代。根据你的蛋白浓度，用2Xbuffer上样就可以了。
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bling[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的溴酚蓝好像加得太少，感觉颜色很淡，多加一点没有关系吧？
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问普通sds所用的考马斯亮兰染色液以及脱色液可以用在tricine－sds跑的胶吗？我用了一次脱色很困难！
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 orangecake 于 2013-6-28 13:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问普通sds所用的考马斯亮兰染色液以及脱色液可以用在tricine－sds跑的胶吗？我用了一次脱色很困难！

你所说的Tricine-SDS是否就是用Tris—Tricine作缓冲系统的电泳，如果是那和Tris—Gly缓冲系统的染色脱色方法没有区别。
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@花开花落@[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近跑了两个组织的电泳。其中一个组织条带扭曲，且有杂带，另外一个组织条带很细。这些组织都在-70摄氏度冰箱里放了三个月，会不会是给放坏了啊？
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memory[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教
如果样品卡在样品槽上
下来的时间很缓慢
理论上只有几十kDa的东西结果对照marker是两百多
做完western只有极上部的地方看的到条带
有何改善方式呢
是否样品处理程序不对?
样品是培养的细胞
用Peirce的lysis buffer加上protease inhibitor
超音波打30秒 加2X loading dye
煮沸五分钟后上样
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966735obeng[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般放－70度冰箱是没有问题的，只要不反复冻融，我的样品放－20度冰箱差不多4个月，结果跑出来的条带还是一样的，比较清晰，重复性也很好。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-6-28 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主您好：
我现在在做Western blotting 。目的蛋白caspase-3，分子量11－32Kd。曝光显影只有一条带可能是β-actin,没有看到目的蛋白，不知道做的过程中哪个地方出了问题。
下面是我做的试验方法步骤。
取2*10（6）细胞加200ul细胞裂解液(购自上海元象公司），另加PMSF终浓度1mmol/L, 14000rpm离心4min, 上清即为提取的蛋白

按照《分子克隆〉，制备12%分离胶和5%浓缩胶：
样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。每孔分别用微量加样器加15μl事先制备好的样品

电泳：40V，4-5h当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源

转膜
剪一块与胶大小一致的PVDF 膜，在甲醇中泡2min钟，按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(参照《分子克隆〉配制。
40V恒压转膜3h。

加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）室温摇床孵育1h。

一抗是兔抗人多克隆抗体1：1000稀释，同时加1：1000稀释的β-actin，4℃过夜。
Washing buffer洗10分钟X 3。
加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗（1：3000）,室温摇床孵育1小时。
Washing buffer洗10分钟X 3。
在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上，曝光盒中曝光1-2min,显影15-30s，定影5min。
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