【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖 - 经验共享

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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

ukonptp[使用道具]
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361

发表于 2013-6-28 14:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教版主个问题：
我用的是5％浓缩胶，12％分离胶，恒流，25mV浓缩胶,40mV分离胶。5*loading buffer(0.313M Tris-HCl pH 6.8,10% SDS, 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol 0.5M DTT),
Fermentas预染marker。为什么我的marker最后一条11KD带总跑不出来，溴酚兰总和17KD的带在一个水平？？？
望指教，谢谢！！！

======================================================================

我们前一阶段也遇到类似的问题，你可以把分离胶调整一下，10-15％之间，看看能不能跑出来。
溴芬兰与17KD在一条线上，说明二者没有完全分开，可以提高胶的浓度。

ukonptp[使用道具]
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362

发表于 2013-6-28 14:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教楼主：
我最近跑电泳浓缩胶很好，到分离胶后溴酚蓝在前沿有扩散，是为什么呢？电压小了吗？浓缩胶是60V，分离胶是120V。

=====================================================

应该是弥散吧？这一般是由于分离胶缓冲液pH不准造成的，建议调整一下！

ukonptp[使用道具]
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363

发表于 2013-6-28 14:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主好啊！
我最近碰到了一个难题，我的胶现在怎么也跑不下来，我的marker 下面有26和20KD的，但是最多能够跑道三分之二左右，就怎么也跑不下来了，我的溴芬兰几乎都快跑出去了，急！
谢谢了！

=============================

分离胶浓度偏大，建议用低浓度的试试

ii077345[使用道具]
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364

发表于 2013-6-28 14:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是新手,目前正在做蛋白质,我现在碰到的问题在你的文章里说了,也就是电压高,但电流却很低,我用的是10%的分离胶,5%的浓缩胶,电压为80V,但电流只有5mA,120V跑浓缩胶时,电流也只有5mA,跑了10个多小时,你罗列了那么多的原因,我只符合一条,那就是没有把那跟塑料条拔掉.但我们这里也有其他的人不拔塑料条,但他们的电流却比我的要高

plaa[使用道具]
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365

发表于 2013-6-28 14:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢"
您建议我用10~12%分离胶的浓度，跑跑看
但是我的Marker建议用15%的分离胶，浓缩胶是5%的。而且我师姐摸的条件，她做出来了。麻烦你。

ukonptp[使用道具]
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366

发表于 2013-6-28 14:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ii077345 于 2013-6-28 14:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是新手,目前正在做蛋白质,我现在碰到的问题在你的文章里说了,也就是电压高,但电流却很低,我用的是10%的分离胶,5%的浓缩胶,电压为80V,但电流只有5mA,120V跑浓缩胶时,电流也只有5mA,跑了10个多小时,你罗列了那么多的 ...

1.如果你制胶的时候是用硅胶条来封闭的话，是一定要去掉的，否则电流无法形成通路。
2.如果硅胶条已经去掉，电压很高，而电流很低的时候，大多就是电泳液少了，同样不能形成电流通路，或通路不好。检查一下内槽或外槽液，是否分别淹没加样孔或电极。

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-28 14:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 plaa 于 2013-6-28 14:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
“我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢"
您建议我用10~12%分离胶的浓度，跑跑看
但是 ...

没有问题的，试验条件做相应的调整，这是很正常的事，关键是结果是否正常。另外你师姐做的很正常，你也可以和他交流一下，毕竟在论坛上讨论的都是大家比较常见的错误，可能针对性差些。如果再有新的问题再讨论。

831226[使用道具]
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368

发表于 2013-6-28 15:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分离胶浓度偏大，建议用低浓度的试试

=================================================================================================

我的目的蛋白不是二十几，我的蛋白是五六十KD的，但是我觉得我的二十几的marker 不能跑下来的话，我的蛋白就不能保证完全跑开。
不是分子量越小，应该跑更大浓度的胶吗？

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369

发表于 2013-6-28 15:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教一下

日前做western，66kd的蛋白，用的5%浓缩胶，12%的分离胶，电泳80～120V，2.5小时，转膜是用的半干法，电流＝膜长度（cm）*膜宽度（cm）*1.56
，时间1小时。但是结果不理想，估计是转膜的问题，请问用什么样的转膜条件比较合适呢？

dog002[使用道具]
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发表于 2013-6-28 15:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教一下

目前我在做目标为5000左右的多肽电泳，采用的是Tricine-SDS-PAGE方法。
我想要的多肽一直都跑不出来，甚至配好的标准品（5mg/ml）都跑不出来。
用该方法跑分子量在1.4KD，2KD的样品，都可以跑出清晰的条带。
因为这个方法尝试了好多次，我怀疑是不是标准品在反复冻融的过程中降解了？
另外还有一个奇怪的现象，我的溴芬兰跑的太快了，往往不到60min中就跑到头了

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