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标题:【求助】目的条带不出

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发表于 2014-3-20 22:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】目的条带不出


初做Western，同时跑两块胶，转膜后，一个做了β-actin，另一个做了目的蛋白，β-actin有条带，但目的蛋白那张膜总是几乎整个显影。用的一抗都是Santa的，二抗是Norgen分装的。β-actin是小鼠抗大鼠单抗，1：2000，二抗1：1000，目的蛋白是羊抗大鼠多抗，1：2000，二抗1：1500。5%脱脂奶粉封闭1.5 h，一抗4度过夜，二抗室温2h。不知原因出在哪里，请高手指教，谢谢！


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发表于 2014-3-20 22:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有时是这样


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发表于 2014-3-20 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但这时β-actin也是有的


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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. The protein might not be abundant.
2. Santa Cruz always recommends to use their primary antibody from 1:100-1:1000 for western blot, is that right? Can you double check your datasheet of the antibody?
3. The antibody might not be good. Sometimes it happens. Call, describe your problem, ask them to send new batch of antibody, or change another antibody to the same protein(eg. C-20--> H300), they have good custom service.
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发表于 2014-3-20 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 chuntian1983 于 2014-3-20 22:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1. The protein might not be abundant.
2. Santa Cruz always recommends to use their primary antibody from 1:100-1:1000 for western blot, is that right? Can you double check your datasheet of the antibo ...

同意，我也觉得是1抗的问题。
其他条件一样的情况下，内参和目的抗体不同，结果不一样，问题一半就是出在抗体上面。
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发表于 2014-3-20 22:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的也是，和你一样样的，actin 很好，就是蛋白出不来。我一抗也是santa
的，二抗是博士德。我第一次买的还有一次做出来，但后来就没有做出来。我后来就又买了一个新的，也是他们公司的，但还是出不来。什么原因阿
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发表于 2014-3-20 22:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量是多大
从β－Actin来看，你的上样量有点儿小……
如果是1.5mm*10mm的上样孔的话，上样量至少可以多达60ug，我们有时上到90ug，参考这个值再试试
另： Actin的量差的有点儿大……
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发表于 2014-3-20 22:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家！
因为还有两个目的蛋白比较小，我这两天又跑了几次Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳，用的是和这个相同的二抗，一抗也是Santa的，看说明书上写推荐浓度1：200-1：1000，我两个目的蛋白的一抗都用了1：500，二抗1：1000，但都是大黑膜，actin也出来了，难道三个一抗都有问题，那我好惨啊！
这三个都是用的同一个二抗，而actin是另一个二抗，但这两个二抗是同一公司的，二抗会不会有问题呢？
我用的是0.75的板，加了10 微升，不好意思，浓度没测，那我上样量小的话，是不是目的蛋白表达不高的话，会测不出来？但现在每次都是全黑Sad
希望大家多提指导意见，谢谢！
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发表于 2014-3-20 22:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

降低一抗、二抗的浓度
我用的也是该公司的抗体，最初是用1：300，1：500，每次都是曝个黑板出来，一气之下就一抗用1：1000，过夜，4度，二抗1:5000,室温2小时，结果背景就可以了
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最简单的
做梯度
上样量从10ul，20ul，30ul做梯度，一抗可以先用1：1000，二抗1：3000
检测的是内源性蛋白还是过表达的蛋白？前者的话确定这个细胞或是组织有这种蛋白吗？后者的话确定质粒表达吗？一句话，最好用阳性对照来检测抗体，否则根本不知道是蛋白还是抗体的问题
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