【求助】目的条带不出 - 经验共享

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标题:【求助】目的条带不出

婴儿脸[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢
今天不加一抗试了试，结果什么都没有，看来就是一抗的问题了，可怎么3个一抗都有问题呀？
现在一抗1：500，1：2000试过（推荐的是1：200-1：1000），二抗1：500，1：1000，1：1500试过（推荐的是1：200-1：500），都是全黑，最淡的一次就是我贴在1楼的那张图，那时一抗1：2000，二抗1：1500做的。不知再降低一抗二抗浓度还有希望出什么？
蛋白是内源性的蛋白，我用的细胞中肯定有表达。用阳性对照怎么做呢?没有提纯的该蛋白呀
我觉得如果没有表达，应该是什么也检测不出来，为什么总是黑膜呢？

eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

知道有表达就得，其实检测抗体的时候一般使用过表达的方法的，用标签抗体确定蛋白表达的情况下，再用蛋白特异性抗体检测，就是我所谓的阳性对照
先加大蛋白上样量，按你已经试过的最大稀释倍数试下吧，背景一般而言就是封闭、抗体稀释倍数、洗膜这些原因，因为没有条带，肯定会长时间曝光以求得到条带，也会出现背景过深，其实背景和条带有时就是个相对值，条带清楚了，背景有点儿，少曝会儿光就OK了，也就不去再计较了

婴儿脸[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #12 eric930 的帖子

谢谢。我的曝光时间不长，因为每次加上发光液就看到整张膜很亮，尤其是膜的周边特别亮，中间相比之下还暗一点，但过一会儿也整个很亮了。

nikun230[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. as wfayew said, measure your protein concentraion, load more proteins. Since the actin bands are very faint, how can you expect your protein bands to be clear...
2. Load positive control---so that you will know if the problem is from your samples or the antibody.
3. Change the antibody---they will send you another one for FREE, why not call them? ps, you can also ask the custom service for some advice.

nikun230[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

In addition, I used to have trouble with Santa Cruz antibody, I am not sure if "lower the antibody concentration" is true or not, in most of my case, I need to increase the primary antibody concentration (to 1:200) and decrease the secondary antibody to get very good bands.

gogo[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 二抗浓度过高可引起背景深、一加发光液就看到整张膜很亮（消耗底物快），进而出现阴性结果，可适当稀释二抗浓度；室温1h；
2. 一抗可定在1：1000左右，室温2h。过高不但背景深、易出现阴性结果；
3. 牛奶封闭4度过夜或室温3h以上，以减少背景；
4. 化学发光最好用fg级；
5. 根据你的目的蛋白长度可调整转膜电流；或根据actin的亮度调整上样量。

婴儿脸[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

洗膜洗得是不是不够干净？

leifengta[使用道具]
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发表于 2014-3-20 22:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你洗多长时间？几次？

婴儿脸[使用道具]
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