蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 34  2/4 ‹‹1234››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图

yyaxw84[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114481
精华 0
积分 307
帖子 334
信誉分 100
可用分 2444
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
11

发表于 2014-4-5 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

130v跑电泳,是不是有点大了,我们都是80v跑浓缩胶，100v跑分离胶.
顶部
misswu61[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79547
精华 0
积分 747
帖子 774
信誉分 100
可用分 4691
专家分 100
阅读权限 255
注册 2011-12-13
状态 离线
12

发表于 2014-4-5 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是蛋白煮的时间或温度不够，煮过的蛋白再跑最好65度5min
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
13

发表于 2014-4-5 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

二抗时间过长了，缩减至30min
顶部
大海啊故乡[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108867
精华 0
积分 193
帖子 125
信誉分 100
可用分 1275
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
14

发表于 2014-4-5 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

130v跑电泳电压不高，如果pH值偏低，恐怕还要加大电压才能跑的快些。
楼主好象没有说是预染marker，所以可能显影，前面我说过。
有个最简单的办法：
转膜后用丽春红染膜。可以看到转膜的情况，然后洗去颜色，可以继续WB一张膜就够了
顶部
Ao7[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76545
精华 1
积分 647
帖子 790
信誉分 102
可用分 4976
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
15

发表于 2014-4-5 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人建议：首先：SANTA的抗体很差劲，其特点就是广而不精，就是什么抗体都有，什么抗体都不好用！你最好换个其他厂家的抗体试试，Abcam、BD的都不错。其次：我以前用也遇到过这类情况，胶顶部总有很亮的非特异性带，有人说可能是蛋白二聚体，你可以查下你的目的蛋白是否有二聚体的形式存在，你可以在煮过蛋白后立即将样品放在冰上冷却，阻止蛋白聚合，我试过，但对我的目的蛋白效果不大，最后还是换了抗体才好。
lucky!
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
16

发表于 2014-4-5 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10%的分离胶，92kD的蛋白按理应该就是在分离胶的上端啊。个人认为目的蛋白的位置没错，只是楼主把marker的大小弄错了而已
顶部
惊醒ing[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108874
精华 0
积分 193
帖子 106
信誉分 100
可用分 1098
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
17

发表于 2014-4-5 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这么多弟兄参与讨论，真让我感动！！现在汇报一下情况，并对部分战友的回答进行解释。
这两天我又在另一个技术比较好的实验室请牛人做了一下，还是没有结果。在90kd处没有条带，反而在40处有两条。现在初步可以判定：要么是我样品制备有问题要么是一抗有问题。至于图中出现的 三条带，应该不是我要的，我也不知道是什么，后来做也没有出现过了。
关于样品制备我觉得没什么难的啊！我的步骤如下：从-80度冰箱取出肺组织，常温解冻，称量，按照公司购买的蛋白裂解液说明书要求，100mg组织加1ml液体，后进行匀浆操作。后12000转离心30min，取上清保存并测量浓度，还蛮高的。再后来就是按照4：1的比例加入loading buffer，将水烧开，丢进去5分钟，取出迅速置于冰上。
我就是这么制备样品的，各位看看有问题吗？？难道是解冻那一步？我觉得这样没什么吧，其它的我就找不出原因了。
顶部
惊醒ing[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108874
精华 0
积分 193
帖子 106
信誉分 100
可用分 1098
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
18

发表于 2014-4-5 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多少伏跑电泳我觉得不是很关键的问题，因为我的电泳液是重复利用的，所以我这个电压是不断的在改变的。事实上，各实验室的所使用的电压也都不一样，能跑出来且好看就行！
顶部
惊醒ing[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108874
精华 0
积分 193
帖子 106
信誉分 100
可用分 1098
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
19

发表于 2014-4-5 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的这个 煮过的蛋白再跑最好65度5min 是什么意思？我一般煮过的用不完的样品我都放在-80度了。下次解冻了直接用，没有再煮了。
顶部
惊醒ing[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108874
精华 0
积分 193
帖子 106
信誉分 100
可用分 1098
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
20

发表于 2014-4-5 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
130v跑电泳电压不高，如果pH值偏低，恐怕还要加大电压才能跑的快些。
楼主好象没有说是预染marker，所以可能显影，前面我说过。
有个最简单的办法：
转膜后用丽春红染膜。可以看到转膜的情况，然后洗去颜色，可以继续WB一张膜就够了
......

=============================================================================================================

我没有说清楚，不好意思，是预染的marker。转膜以后可以非常清楚的看到marker，并且正反面我都不用标记了，因为正面的marker颜色深，而膜反面的颜色浅。我也用丽春红染膜，也能看到条带，转膜是应该没问题。
顶部
 34  2/4 ‹‹1234››