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标题:【讨论贴】蛋白质大生产，欢迎群友参与～～～

remenb[使用道具]
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发表于 2014-4-19 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您所说的层析用填料的载量吗？
自己来确定填料载量的确很麻烦，我们用的多得是买来的QIAGEN的Ni-NTA，它应该有载量验证文件，但我的确没有想过这个问题，也没有看过相关文件。因为我们使用时就是根据它所标称的理论载量来计算所需填料体积的。根本没有想过做这方面的验证，在药监局的检查中也没有过异议。按理说Ni-NTA再生后是应该确定载量的，这里应该有个验证，但是的确没有做过。
顺便提一句，就我使用的经验来说，进口填料的标称理论载量都略小于填料实际的载量，也就是说实际上比说明书上写的要大一些。看来老外们做事很有分寸也很严谨啊。
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发表于 2014-4-19 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是指填料的载量
确定载量，也是为了更好的节约成本，因为我们现在的产品附加值并不是特别高，而纯化往往也是成本最重要的部分
老外的确很严谨，曾经听别人说过，老外真的做CIP，用AKTAexplorer，做一百次，然后验证，感觉好奢侈哦，呵呵
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发表于 2014-4-19 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问大生产纯化过程中Tris-Hcl缓冲体系，是不是不能用于制药报药方面。
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-4-19 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Tris-HCl可以用于制药方面，但是最好要根据产品的性质确定是否可以用，因为Tris是多氨基化合物，你至少要保证你的产品不与之反应，并且所用试剂也最好不能与Tris有反应，否则就要有相关物质的检验方法才行。因为Tris是极为常用的缓冲体系，有时这一点就容易被忽略了。而且Tris体系成本要高于磷酸盐缓冲体系，成本也要考虑。
举个不恰当的例子，以前我上学时做酶的固定化，用酶的游离氨基与固定化载体的环氧基反应，但是就是忽略了Tris的反应能力，所以采用了Tris作为缓冲液。结果Tris 与载体反应了很多，酶都没有连接上。换了磷酸盐就好了：）
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发表于 2014-4-19 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.
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发表于 2014-4-19 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lixi559 于 2014-4-19 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.


疏水层析pH：在pH5-8.5范围内疏水作用没有很大变化，pH<5.0疏水作用增加，pH>8.5疏水作用减弱
如果用上样高盐的buffer去处理样品，我做的大部分为破胞产物，所以在菌体复溶时就用上样buffer，大部分还是挺容易重复的，没遇见你所说的情况。能举例说一下吗？谢谢
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意，一般Capture都不会选择亲和，因为第一步的Capture毕竟杂蛋白还是比较多的

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Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.


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ukonptp[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在研发设计过程中，其实经过预装柱对填料的初选后，就要进行一些初步的计算，因为前面我们也说了：对于层析参数的线性放大的一般原则是：
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积
所以在小规模必须估计你装多高的填料，放大以后使用什么样的柱子能满足你的生产要求
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近也在做蛋白纯化，感觉步骤挺繁琐，而且丢失也比较多，特别是用层析柱的方法，最后得率往往都很低，仅做实验用的蛋白有时候就要做好几次，很费时费力，再大量制备运用到实际（如临床）估计更难。所以，我也同大家一样，觉得纯化工艺要放大！还希望大家多多指教：）
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