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标题:【求助】目的基因在大肠和酵母中都不表达？

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 INK 于 2014-5-27 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

按照你的做法，你在你的目的蛋白N端融合上了太多的氨基酸了（好象大约有５０个左右），你的蛋白本来就大，现在更大了，如果你的序列中没有NdeI位点，你能不能尝试使用NdeI这个位点来表达看看呢？ ...

还有一个办法：上游用NdeI位点，下游设计引物时去掉基因里的终止密码子，这样就在基因末端加上了His Tag，比在前端加His Tag要少40个额外的氨基酸，准备试试看！
你觉得怎么样？？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的目的基因是在E.coli里表达我换了3种载体和相应的表达宿主，SDSPAGE结果和你的一样，你提到的优化条件也试过了，结果还是一样，也是很郁闷。后来我用标签抗体做了一次WESTERN 发现并不是不表达，只是表达量很低。
你是不是也考虑下western blot?
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白是不是有跨膜区，软件分析一下，如果有，去掉跨膜区
试一下低温，低速长时间在大肠杆菌里表达
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lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wmp1234 于 2014-5-27 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的目的基因是在E.coli里表达我换了3种载体和相应的表达宿主，SDSPAGE结果和你的一样，你提到的优化条件也试过了，结果还是一样，也是很郁闷。后来我用标签抗体做了一次WESTERN 发现并不是不表达，只是表达量很低。
你是不是 ...

嗯，你的话又给了我希望
这几天我正在做WESTERN，就是抗体稀释倍数不好掌握啊，His一抗还是蛮贵的，20微升就300多，还是国产的，试不起啊！请问你当时用的多大的？
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lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xyw5 于 2014-5-27 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的蛋白是不是有跨膜区，软件分析一下，如果有，去掉跨膜区
试一下低温，低速长时间在大肠杆菌里表达

有跨膜区就会分泌到胞外吗？
用什么软件分析，能不能介绍一下啊？
最低温已试到25度，210rpm摇过夜还是一样检测不到
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发表于 2014-5-27 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

EXpasy网站上的DAS，在线的
我师姐好像用过18度过夜，上清表达了
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lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

查过了，不是膜蛋白!
基因上稀有密码子比较多，谁有宿主菌Rosetta，能否交换一下啊？
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lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

急求宿主菌Rosetta！可以交换
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-5-27 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我曾经做过二十多种基因在大肠杆菌中的表达,也表达过90多KD的蛋白,表达量也很不错
建议: 分子量大的不建议用pET30,通常会选用pET15
建议用低温诱导,曾经做过15度低温,诱导过夜,中途补加Amp,添加葡萄糖
疑问? 你的电泳是全菌电泳还是上清电泳
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IAM007[使用道具]
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发表于 2014-5-27 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得楼主的杂蛋白太多，不是很正常。
楼主是用哪种培养基培养表达的？
还有甲醇浓度是多少？这些都很有影响的
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