蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】相当的郁闷，pet28a/BL21(DE3)系统不表达

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标题:【求助】相当的郁闷，pet28a/BL21(DE3)系统不表达

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冒昧说一句，pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达
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#甜#[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一个问题,如何检查表达的序列中是否含有稀有密码子?Rosetta-gami(DE3)和BL21(DE3)有些什么区别呢?
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是用的pet28a/BL21(DE3)，诱导了好几次，几个片断都不表达！不知把片断切下来，换成KG载体行不行？请高手
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
优化培养条件应该有很多工作可以做，表达条件不同产量相差极大。
你诱导之前菌浓度合适么？有时候培养稍微过头了点再诱导就不表达了。
你也可以用乳糖来诱导；培养基中加葡萄糖等。
如果愿意花点钱的话，试试Novagen的自诱导培养基。
当然，换载体融合表达可能就表达了Smile
预祝表达成功Smile
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尘朵朵[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达 。
原因出在这里？？我记得看过有文章里用pet28a/BL21(DE3)表达系统的啊！
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尘朵朵[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
优化培养条件应该有很多工作可以做，表达条件不同产量相差极大。
你诱导之前菌浓度合适么？有时候培养稍微过头了点再诱导就不表达了。
听了感觉好恐怖，一直以来坐表达诱导前测OD值一步都没有太当一回事，也没有做不同OD值诱导的对照，也许是实验做的太不严谨了。另外也可以用乳糖来诱导或培养基中加葡萄糖等是用来优化诱导的还是在IPTG诱导不行时可以尝试的？能不能提供具体一点的信息。
我现在已经改用pet32a/Rosetta-gammi(DE3)来表达，本想偷点懒快点出结果的，质粒与片断双酶切连接后直接转化Rosetta-gammi(DE3)，为了减少空载体转化的现象，双酶切都过夜双酶切完全，转化DE3后也都长了克隆，按道理长的克隆应该都是阳性的啊，不幸的是挑不出阳性，难道长的这些克隆还是空载体？晕，看来是预速则不达了，得重新转化DH5a再提质粒了。
谢谢各位的指导。
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了了[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达 。
??
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 了了 于 2014-5-31 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达 。
??

这点可是不对的吧，应该很适合在原核表达吧
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发表于 2014-5-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pET有真核表达元件么
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

和楼主有着同样的命运!
首先说明几个问题:
1:Rosetta2-gammi(DE3)既能够补充稀有密码子(7个),也能够帮助形成二硫键.有利于诱导出活性蛋白.但诱导产量较BL21(DE3)稍低.
2:pET28a是原核表达表达载体.
3:Rosetta2-gammi(DE3)是氯霉素抗性,和pET28a的卡那抗性不同,可以筛选.
我的蛋白也不表达,但只粗摸过诱导条件,更换载体后37度跑胶前后也无差别.
PMAL和PGEX都构建了,依然没有表达.
准备细摸条件.希望各位有什么经验教训不吝赐教啊!
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