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标题:【求助】pcr引物退火温度低时没有产物,高温就有，为什么呢

douding66[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】pcr引物退火温度低时没有产物,高温就有，为什么呢


pcr是梯度pcr，引物退火温度51,52，53，54，55度等都没有产物,58度就有,这是为什么啊
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douding66[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不一定是有多带，PCR影响因素很多。

======================================================================

恩，我可以理解，但是我想知道是什么因素产生了这种结果，除了退火温度其他条件都是一样的
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dream2013[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

低的退火温度下，更容易发生非特异匹配，不能形成有效扩增，所以没有产物。
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douding66[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 dream2013 于 2014-8-27 10:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

低的退火温度下，更容易发生非特异匹配，不能形成有效扩增，所以没有产物。

我知道啊，所以应该有多带啊，而不是没有带啊，而高温却有带
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dream2013[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 douding66 于 2014-8-27 10:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我知道啊，所以应该有多带啊，而不是没有带啊，而高温却有带

不一定是有多带，PCR影响因素很多。
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发表于 2014-8-27 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会和荧光定量PCR类似，存在一个阈值温度，在其他温度下，产物的片段存在但，无法检测出。一旦超过了这个阈值，可以检测到了，毕竟，PCR的扩增是以指数形式表现的。
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douding66[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ending 于 2014-8-27 10:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

会不会和荧光定量PCR类似，存在一个阈值温度，在其他温度下，产物的片段存在但，无法检测出。一旦超过了这个阈值，可以检测到了，毕竟，PCR的扩增是以指数形式表现的。 ...

恩，谢谢，有可能，pcr是什么可能都会发生的
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utt0989[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的是高保真酶吗?
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pou[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般情况下的原因是扩增的PCR序列中有比较强的二级结构，当温度较低的时候模板的二级结构无法打开，DNA聚合酶无法通过该二级结构完成整个片段的扩增，当温度高的时候二级结构才打开。如需进一步验证请自行查阅荧光定量PCR设计中的目标片段二级结构问题。有个软件叫mfold可以给出预测。虽然你这是DNA，但与RNA配对原理一致，属于触类旁通范围
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douding66[使用道具]
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 小中大


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原帖由 utt0989 于 2014-8-27 10:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你用的是高保真酶吗?

不是，普通酶
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