小中大[求助]蚀斑实验
目前在做病毒蚀斑实验，做了好几次感觉都不成功，并没有出现自己想象中的空斑，想向大家请教下：
使用的病毒：TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）
细胞：ST细胞
含中性红营养琼脂制备：将低熔点琼脂糖称好后直接紫外线照射1h杀菌，加入不含酚红的DMEM中（琼脂糖终浓度2%），65度加热10-15 min，冷却至室温，向营养琼脂中加入中性红（中性红终浓度为万分之一）后覆盖细胞。
方法：基本参照《动物病毒学第二版》，殷震主编。简略如下：消化细胞后铺12孔板，生长两天，细胞90%汇集。病毒10倍梯度稀释（稀释梯度10倍至10万倍），向细胞孔中加入稀释病毒液0.5 mL，37度吸附2 h，吸弃病毒液，DMEM洗涤细胞一次，加入含中性红营养琼脂，室温避光放置2h，37度避光培养3天（由于中性红见光分解有毒性，故中途没有取出细胞观察）。
结果：
未接毒细胞基本都被染为红色，细胞状态良好，整个细胞孔的颜色为浅红色。
接毒细胞孔中细胞大量死亡，基本无病毒稀释度的差异，整个细胞孔的颜色为浅黄色，很难看出空斑（有时，个别孔细胞死亡较少时，能看见模糊的斑，但很不明显）。
问题：
1：为什么接毒细胞孔中细胞大量死亡，基本无病毒稀释度的差异？是否是我的病毒稀释度还是不够？所以导致接毒细胞孔中的细胞成片死亡？或者还是观察时间过晚，病毒已经完全扩散开来了？
2：我搜了搜以前的帖子，看见有些用双层琼脂，这个是否是因病毒不同而异？
3：我想下一次实验，用营养琼脂覆盖细胞，但不加加中性红，每天观察细胞，待细胞出现病变后，在直接在琼脂上加中性红去染细胞，但不知道，在这种情况下，中性红使用浓度多大合适？染色多长时间？
