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标题:[求助]如何分离外周血单个核细胞

8princess8[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何分离外周血单个核细胞




我想分离PBMC来研究TH1，2细胞，有些问题请教
1、有同学说，不用分离，直接刺激，再使用流式细胞仪检查CD3,8和IL-4，IFN-gamma，我觉得有些不妥，不知是否可行？
2、现在使用有什么方法可以分离？使用淋巴分离液吗？
我是新手，请各位指教。谢谢
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101010[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、需要分离。
2、Ficoll密度梯度离心即可。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为你染得都是胞内，所以最好还是分离，这样效果比较好。分离液一定要买好，这个区别还是比较大的
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做从外周血中分离CD4+T细胞和CD8+T细胞，是买的磁珠分离试剂盒，超贵。但是这样分离的纯度高，后面的实验需要比较多这2种细胞。
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不清楚你的研究目的是什么

如果只是想单纯测一下外周血中Th1，Th2细胞的表达比例，就不用分离PBMC，直接用抗凝全血做就行。将全血和培养基1：1稀释后加入PMA，离子霉素和莫能霉素，培养箱中孵育4-6小时，然后再标记CD3、CD4和胞内因子。

如果你想把这2群细胞分选出来，体外继续培养研究他们的功能就要先用Ficoll分出PBMC，然后用磁珠或流式直接分选。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不清楚你的研究目的是什么

如果只是想单纯测一下外周血中Th1，Th2细胞的表达比例，就不用分离PBMC，直接用抗凝全血做就行。将全血和培养基1：1稀释后加入PMA，离子霉素和莫能霉素，培养箱中孵育4-6小时，然后再标记CD3、CD4和胞内因子。

如果你想把这2群细胞分选出来，体外继续培养研究他们的功能就要先用Ficoll分出PBMC，然后用磁珠或流式直接分选。

————————————————————————————————————

没有你这种做法，全血就想测Th1或者Th2？这样的结果别人是不会承认的。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用Ficoll分离PBMC纯度不是很高，但是便宜，用磁珠分离纯度就很高了，价格偏贵点
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-3-23 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用Ficoll分离PBMC纯度不是很高，但是便宜，用磁珠分离纯度就很高了，价格偏贵点

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用Ficoll密度梯度离心法得到的就是PBMC，什么叫纯度不是很高？

用磁珠分离的话应该是进一步分离PBMC中的某一种细胞才用的，如需要进一步分离其中的T细胞或者B细胞等才用磁性分离。
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tieshazhang[使用道具]
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 小中大
我做从外周血中分离CD4+T细胞和CD8+T细胞，是买的磁珠分离试剂盒，超贵。但是这样分离的纯度高，后面的实验需要比较多这2种细胞。

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就算是用磁珠分离也应该是先用ficoll 先分离了PBMC再用啊，难道直接把磁珠用在全血吗？这样不经MACS试剂的用量大增，还会有大量细胞，包括红细胞，通过分离柱，很容易就堵啊
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8princess8[使用道具]
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 小中大

我们想研究外周血中的TH1/2，CD4+CD25+Treg细胞的表达情况，明确外周血全身的获得性免疫的状态。
同样的指标在疾病局部组织中的表达情况，进一步研究全身和局部的T细胞之间的相关性。
我还有问题想问问：
1、Iuduced Treg的培养是否需要IL-10或TGF-beta? 比如 tr1 ，有些文章中好像就跟普通的TH细胞一样，刺激后一起检查他们。
2、目前，Tr1 的指标CD4（CD3、8代替）+,CD25+,IL-4- IL-10+,是否正确？
3、IL-4荧光是不是标PE会好些？
4、如果想检查TH17，应该如何选择抗体？IL-17？
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