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标题:[求助]MTT实验中 显微观察结果与OD测量值不一致

abc816[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]MTT实验中 显微观察结果与OD测量值不一致




最近做MTT实验，经常出现 加完MTT后细胞中紫色结晶生成情况通过显微镜观察，发现实验组梯度明显，生成量与加药量有明显正相关，之后用DMSO溶解后，颜色无明显差异，OD值在各实验组中也无明显差别，很困惑啊，希望虫友帮着分析下，先谢了。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

俺以前做氢3-TDR时没有遇到过这种现象，最近又开始养细胞，流行用MTT啦，发现细胞破坏成明显梯度，药物浓度最大孔都没有完整细胞啦，加MTT后俺1小时-6小时不同时间段结束，嗨颜色都1样，郁闷啊。是B16细胞和TC-1。跟你1起等高人。
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是按照MTT的标准程序做的吗，操作过程详细说一下～
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
俺是按西格玛手册，是B16和TC-1细胞。

1，细胞3000-5000铺板过夜，
2，加样品，
3，72小时加MTT，
4，4小时加终止液。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加完MTT孵育4小时候，一种方法是弃掉上清，再加DMSO或其他工作液，溶解结晶，检测；还有一种是不弃掉上清，直接将工作液加入，溶解结晶，检测。

不知你用的是哪种。如果细胞污染，OD值都会很高。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嘿嘿，俺解决啦。

俺在72小时全部倒去96孔板中的培养基，取10ML新鲜培养基加好MTT后用8道排枪100ul/孔，培养4小时加SDS溶解液，梯度非常好。

看来是营养限制了好细胞代谢MTT（或者代谢负产物抑制），另外我认为破碎细胞容出的细胞器在相当滴时间内仍然能够代谢MTT。
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abc816[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢两位的交流。
我的流程是：100ml细胞悬液铺板，24小时候加入 100ml培养基配置的各浓度药液，24/48小时后直接加入20mlMTT，4小时后弃上清，加入DMSO溶解测OD值。
看来这种做法容易出问题，向两位学习啦！
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发表于 2012-3-23 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主和我遇到了相同的问题，不过这两天我正好解决了，分享一下我的失败经历吧

刚开始我的做法和楼主一样，100ul铺板，细胞数5000-10000个/孔，贴壁12h后加入药物作用，
约36-48h后直接加入MTT20ul，反应4h后，弃上清液，加入150ulDMSO溶解，测定吸光度。
结果就出现了溶解后数据差异不明显的现象。后来，我做了血清和1640培养基分别与MTT的作用，发现血清能使MTT形成紫色物质，而且该物质用DMSO溶解后，在492--570nm均有较强的吸收，我就认定培养基中血清的存在与MTT作用导致了药物抑制细胞的阳性结果不明显。于是，我尝试在加入MTT之前，弃掉原来的含血清培养基，并用PBS洗一次，然后更换为新鲜的不含血清的1640，再加入MTT作用，效果立马就出来了，作用梯度随药物的浓度变化很明显----------

6楼的朋友和我解决的办法基本类似，

楼主可以尝试一下在加入MTT钱更换新鲜的不含血清培养基---

祝楼主实验成功！
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发表于 2012-3-23 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主和我遇到了相同的问题，不过这两天我正好解决了，分享一下我的失败经历吧

刚开始我的做法和楼主一样，100ul铺板，细胞数5000-10000个/孔，贴壁12h后加入药物作用，
约36-48h后直接加入MTT20ul，反应4h后，弃上清液，加入150ulDMSO溶解，测定吸光度。
结果就出现了溶解后数据差异不明显的现象。后来，我做了血清和1640培养基分别与MTT的作用，发现血清能使MTT形成紫色物质，而且该物质用DMSO溶解后，在492--570nm均有较强的吸收，我就认定培养基中血清的存在与MTT作用导致了药物抑制细胞的阳性结果不明显。于是，我尝试在加入MTT之前，弃掉原来的含血清培养基，并用PBS洗一次，然后更换为新鲜的不含血清的1640，再加入MTT作用，效果立马就出来了，作用梯度随药物的浓度变化很明显----------

6楼的朋友和我解决的办法基本类似，

楼主可以尝试一下在加入MTT钱更换新鲜的不含血清培养基---

祝楼主实验成功！

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我试了一下,梯度有了,貌似细胞被我冲掉了一些,总的来说效果不错,谢了
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jujuba[使用道具]
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发表于 2012-3-23 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
奇怪，我用含血清培养基做空白对照，OD492一般就0.08左右而已啊。是否MTT厂家不同导致的？
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